Madeya destpêkê: ARN
Veguheztina berevajî ya hejmarî PCR (RT-qPCR) rêbazek ceribandinê ye ku di ceribandinên PCR de bi karanîna RNA wekî materyalê destpêkê tê bikar anîn.Di vê rêbazê de, ARN-ya tevahî an RNA-ya peyamber (mRNA) yekem car ji hêla transkrîptaza berevajî ve di ADN-ya temamker (cDNA) de tê veguheztin.Dûv re, reaksiyonek qPCR bi karanîna cDNA wekî şablon hate kirin.RT-qPCR di cûrbecûr sepanên biyolojiya molekulî de, di nav de analîza vegotina genê, pejirandina navbeynkariya RNA, pejirandina mîkroarray, tespîtkirina pathogen, ceribandina genetîkî, û lêkolîna nexweşiyê de, tê bikar anîn.
Rêbazên yek-gav û du-gav ji bo RT-qPCR
RT-qPCR dikare bi rêbazek yek-gavek an du-gavek pêk were.RT-qPCR-ya yek-gavekî veguheztina berevajî û zêdekirina PCR-ê li hev dike, rê dide ku transkrîptaza berevajî û DNA polîmeraza reaksiyonê di heman boriyê de di bin heman şert û mercên tamponê de temam bikin.RT-qPCR-ya yek-gavekî tenê pêdivî bi karanîna primerên rêzikên taybetî hewce dike.Di RT-qPCR-ya du-gavekî de, veguheztina berevajî û zêdekirina PCR-ê di du lûleyan de, bi karanîna tamponên xweşbînkirî yên cihêreng, şert û mercên reaksiyonê, û stratejiyên sêwirana pêşîn têne kirin.
| Berjewendî | Lidijî | |
| Yek Step | Vê rêbazê kêm xeletiya ceribandinê heye ji ber ku her du reaksiyonên di yek boriyê de têne kirin
Kêm gavên pipetkirinê metirsiya qirêjbûnê kêm dike
Minasib ji bo zêdekirin/çapkirin, bi lez û berbelav e | Reaksiyonên du-gav nikarin ji hev veqetînin
Ji ber ku şert û mercên reaksiyonê bi berhevkirina reaksiyona du-gavekî têne tawîz kirin, hesas ne bi qasî ya rêbaza du-gavekî ye.
Hejmara hedefên ku ji hêla yek nimûneyê ve têne kifş kirin hindik e |
| Du Steps | Qabiliyeta afirandina pirtûkxaneyên cDNA-ya stabîl ên ku dikarin ji bo demên dirêj werin hilanîn û di reaksiyonên pirjimar de werin bikar anîn.
Genên armanc û genên referansê dikarin ji heman pirtûkxaneya cDNA bêyî hewcedariya pir pirtûkxaneyên cDNA werin zêdekirin.
Tamponên reaksiyonê û şertên reaksiyonê yên ku xweşbînkirina reaksiyonên yekane pêk tîne
Hilbijartina maqûl a şert û mercên tehlikê | Bikaranîna pir lûleyan, û gavên pitir pîpkirinê xetera gemarbûna DNA zêde dike, û dem dixwe.
Ji rêbaza yek-gavekî bêtir xweşbîniyê hewce dike |
Berhemên têkildar:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Yek Gav)-SYBR Kesk I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Yek Gav)-Taqman
RT Easyᵀᴹ I Master Premix For First-Strand CDNA Synthesis
Hilbijartina ARN û mRNA ya tevahî
Dema ku ceribandinek RT-qPCR tête sêwirandin, girîng e ku meriv biryar bide ka meriv RNA-ya tevahî an mRNA-ya paqijkirî wekî şablonek ji bo veguheztina berevajî bikar bîne.Her çend mRNA dikare hesasiyetek hinekî bilindtir peyda bike jî, ARN-ya tevayî hîn jî pir caran tê bikar anîn.Sedema vê yekê ew e ku ARN-ya tevayî ji mRNA wekî madeya destpêkê xwedî avantajek girîngtir e.Pêşîn, pêvajo kêmtir gavên paqijkirinê hewce dike, ku ji bo destpêkirina hejmarên hucreyê vegerandina jimarî ya çêtir a şablonê û normalîzekirina çêtir encaman peyda dike.Ya duyemîn, ew ji pêngava dewlemendkirina mRNA-yê dûr dikeve, ku dikare ji ber vegerandinên cihêreng ên mRNA-yên cihêreng, ji îhtîmala encamên şikestî dûr bixe.Bi tevayî, ji ber ku di pir sepanan de pîvana têkildar a genê armanc ji hesasiya bêkêmasî ya tespîtê girîngtir e, ARN-ya tevahî di pir rewşan de maqûltir e.
Destpêka veguheztina berevajî
Di rêbaza du-gavekî de, sê awayên cihêreng dikarin werin bikar anîn da ku reaksiyona cDNA-yê bide destpêkirin: primerên oligo(dT), primerên rasthatî, an primerên taybetî yên rêzê.Bi gelemperî, primerên oligo(dT) û primerên rasthatî bi hev re têne bikar anîn.Van primers bi şablonê şablonê mRNA vedihewînin û transkrîptaza berevajî bi xala destpêkê ya sentezê peyda dikin.
| Hilbijartina Primer | Structure û fonksiyonê | Berjewendî | Lidijî |
| Destpêka oligo(dT) (an oligo(dT) ya lengerkirî) | Zêdekirina pêçana bermahiyên tîmînê yên li dûvika poly(A) ya mRNA;lenger oligo(dT) primer G, C, an A di dawiya 3' de heye (malpera lenger) | Senteza cDNA-ya tev-dirêj ji mRNA-ya polî(A)-dûvik
Dema ku kêm materyalê destpêkê peyda dibe tê sepandin
Malpera ankorkirinê piştrast dike ku yekema oligo(dT) bi dûvika 5' poly(A) ya mRNA ve girêdide. | Tenê ji bo zêdekirina genên bi dûvikên poly(A) re maqûl e
CDNA-ya ku ji cîhê pêşîn *2 di polî(A) de qutkirî bistînin bistînin
Beralîkirî ye ku bi dawiya 3′ ve girêdayî ye *
*Ger primerên oligo(dT) yên ankorkirî bên bikaranîn ev îmkan kêm dibe |
| primerê rasthatî
| Dirêjahiya 6 û 9 bingehan, ku dikarin di dema veguheztina RNA de li gelek deveran bişewitînin | Ji hemî ARN-an re (tRNA, rRNA, û mRNA) vedihewîne.
Ji bo transkrîpsiyonên bi strukturên duyemîn ên girîng, an dema ku kêm materyalê destpêkê peyda dibe maqûl e
Hilberîna cDNA ya bilind | cDNA ji hemî ARNyê berevajî tê veguheztin, ku bi gelemperî nayê xwestin û dibe ku îşaretek mRNA-ya armanc kêm bike.
cDNA qutkirî bistînin |
| primerên rêzikên taybet | Destpêkên xwerû rêzikên mRNA yên taybetî hedef digirin | pirtûkxaneya cDNA ya taybetî
Hesasiyetê çêtir bikin
Bi karanîna primerên qPCR berevajî | Tenê bi senteza genek armancek yekane sînorkirî ye |
Reverse transkriptase
Transkriptaza berevajî enzîmek e ku ARNyê ji bo sentezkirina ADNyê bikar tîne.Hin transkriptazên berevajî xwedan çalakiya RNase ne û piştî transkrîpsiyonê dikarin ristên RNA-yê di rêzikên hîbrîd ên RNA-DNA de hilweşînin.Ger ew xwedan çalakiya enzîmatîk a RNase nebe, RNaseH dikare ji bo kargêriya qPCR bilindtir were zêdekirin.Enzîmên ku bi gelemperî têne bikar anîn transkrîptaza berevajî ya virusê leukemiya mûşê Moloney û transkrîptaza berevajî ya virusê myeloblastoma avian hene.Ji bo RT-qPCR, îdeal e ku meriv transkrîptazek berevajî ya bi germahîya bilindtir hilbijêrin, da ku senteza cDNA di germahiyên bilind de were kirin, veguheztina serketî ya RNA-yên bi strukturên duyemîn bilindtir misoger dike, di heman demê de çalakiya xwe ya tam li seranserê reaksiyonê diparêze, û di encamê de hilberîna cDNA-ya bilindtir dibe.
Berhemên têkildar:
Foreasy M-MLV Reverse Transcriptase
Çalakiya RNase H ya transkrîptaza berevajî
RNaseH karibe ristên RNA ji dupleksên RNA-DNA hilweşîne, rê dide senteza bikêrhatî ya ADN-ya dubendî.Lêbelê, dema ku mRNA-ya dirêj wekî şablonek tê bikar anîn, dibe ku RNA ji zû de hilweşe, û di encamê de cDNA qut bibe.Ji ber vê yekê, ger tê xwestin ku senteza transkrîptên dirêj were xwestin, kêmkirina çalakiya RNaseH di dema klonkirina cDNA de bi gelemperî sûdmend e.Berevajî vê, transkriptazên berevajî yên bi çalakiya RNase H bi gelemperî ji bo sepanên qPCR sûdmend in ji ber ku ew helîna dupleksên RNA-DNA di dema yekem çerxa PCR de zêde dikin.
Design Primer
Destpêkên PCR-ê yên ku ji bo qonaxa qPCR di RT-qPCR de têne bikar anîn divê bi îdeal bêne sêwirandin da ku li hevbendek ekson-ekson bigire, li cihê ku primera amplification dikare bi potansiyel sînorek rastîn a exon-intronê bigire.Ji ber ku rêzikên ADN-ya genomîk ên ku întron vedihewîne nayên zêdekirin, ev sêwirandin xetera pozîtîfên derewîn ên ku ji tevlihevkirina ADNya genomîk têne zêdekirin kêm dike.
Ger prîmer nikaribin ji bo veqetandina exon an sînorên exon-eksonan werin sêwirandin, dibe ku hewce be ku nimûneyên RNA bi DNase I an dsDNase-ya bê RNase were derman kirin da ku gemariya DNA ya genomîk were rakirin.
Kontrola RT-qPCR
Pêdivî ye ku kontrolek neyînî ya veguheztina berevajî (kontrola -RT) di hemî ceribandinên RT-qPCR de were destnîşankirin da ku tevliheviya DNA (wek DNA-ya genomîk an hilberên PCR ji reaksiyonên berê) were tespît kirin.Ev kontrol ji bilî transkriptaza berevajî hemî pêkhateyên reaksiyonê dihewîne.Ji ber ku bi vê kontrolê ve transkrîpsiyona berevajî çênabe, heke zêdekirina PCR were dîtin, îhtîmala herî mezin gemarîbûna ji DNA ye.
Dema şandinê: Tebax-02-2022
