Ⅰ. Hestiyariya pergala reaksiyonê zêde bikin:

1. RNA-ya kalîteya bilind ji hev veqetîne:

Senteza cDNA ya serketî ji RNA-ya kalîteya bilind tê.Pêdivî ye ku RNA-ya kalîteya bilind bi kêmî ve bi tevahî dirêjtir peyda bike û nehêle ku enzîmên tomarkirinê, wek EDTA an SDS, nehewîne.Qalîteya RNA nirxa herî zêde ya agahdariya rêzika ku hûn dikarin li cDNA-yê veguherînin diyar dike.Rêbaza paqijkirina RNA ya gelemperî rêbazek gavê ye ku isoocyanate/acidophenol bikar tîne.Ji bo ku pêşî li qirêjiya RNase were girtin, ARNya ku ji nimûneyek bi RNase (wek pankreas) dewlemend tê veqetandin, pêdivî ye ku formaldehyde were hilanîn da ku RNA-ya kalîteya bilind xilas bike, ku ji bo hilanîna dirêj-dirêj hîn bêtir wusa ye.ARNya ku ji kezeba mişkê tê derxistin di bingeh de piştî hefteyek hilanîna di avê de hate hilweşandin, dema ku ARNya ku ji kezeba mişkê hat derxistin piştî sê salan hilanîna di avê de stabîl ma.Wekî din, transkrîptên ji 4kb mezintir hesastir in ji bo şopandina hilweşîna RNase ji transkrîptên piçûk.Ji bo zêdekirina îstîqrara nimûneya RNA ya hilanînê, RNA dikare di metalmamînek îyonê de were hilweşandin, û -70 °C tê hilanîn.Thylide ku ji bo rizgarkirina ARN-ê tê bikar anîn, divê tiştek cûrbecûr ku ARN-ê hilweşîne nehewîne.ARN ya ku ji pankreasê tê, herî kêm salek dikare di methalmamine de were hilanîn.Dema ku hûn amade ne ku ARN-ê bikar bînin, hûn dikarin van awayên jêrîn bikar bînin da ku ARN-ê bibarînin: NaCl bi 0,2 m û 4 carî ji qebareya etanolê zêde bikin, germahiya odeyê 3-5 hûrdem bixin û 10,000 × g centrifûgal 5 hûrdeman bikin.

2. Bêyî çalakiya RNaseH (RNaseH-) transkrîptaza berevajî bikar bînin:

Inhibitors RNase bi gelemperî ji bo berevajîkirina reaksiyonên transkripsiyonê têne zêdekirin da ku dirêjahî û hilberîna senteza cDNA zêde bikin.Inhibîtorê RNase di reaksiyona senteza zincîra yekem de li ber hebûna tampon û ajanên kêmker ên mîna DTT tê zêdekirin ji ber ku pêvajoya senteza pêş-cDNA frenkê denature dike, bi vî rengî RNazên girêdayî yên ku RNA-yê hilweşînin berdide.Inhibîtorê proteîna RNase tenê pêşî li hilweşandina RNA ji hêla RNase A, B, C ve digire û rê li ber RNases li ser çerm nagire, ji ber vê yekê divê baldar be ku RNases ji tiliyan tevî karanîna van înhîbîtoran neyên danîn.

Transkrîptaza berevajî veguherîna ARNyê di cDNA de katalîz dike.Hem M-MLV û hem jî AMV ji bilî çalakiya xweya polîmerazê xwedan çalakiya RNaseH ya endojen in.Çalakiya RNaseH bi çalakiya polîmerazê re ji bo rêzikên heterozîgot ên ku di navbera şablonên RNA û primerên ADN-ê an rêzikên dirêjkirina cDNA de têne çêkirin re pêşbaziyê dike, û RNA: Rêzên RNA di kompleksên ADNyê de hilweşîne.Şablonên RNA yên ku ji hêla çalakiya RNaseH ve têne hilweşandin êdî nikarin wekî substratên bi bandor ji bo senteza cDNA-yê werin bikar anîn, hilberîn û dirêjahiya senteza cDNA kêm dike.Bi vî rengî rakirin an pir kêmkirina çalakiya RNaseH ya transkrîptaza berevajî dê feydeyek mezin be.

SuperScriptⅡ transkrîptaza berevajî, MMLV transkrîptaza berevajî ya RNaseH- û thermoScript transkrîptaza berevajî, AMV ya RNaseH- ji MMLV û AMV-ê cDNA-ya tev-dirêjtir derxist.Hesasiyeta RT-PCR ji hêla mîqdara cDNA ya hatî çêkirin ve tê bandor kirin.ThermoScript ji AMV pir hesastir e.Mezinahiya hilberên RT-PCR ji hêla kapasîteya transkriptaza berevajî ya ji bo sentezkirina cDNA ve tê sînorkirin, nemaze dema ku Cdnayên mezintir klon dikin.Li gorî MMLV, SuperScripⅡ bi girîngî hilberîna hilberên dirêj ên RT-PCR zêde kir.Transkriptaza berevajî ya RNaseH- di heman demê de aramiya termal jî zêde dike, ji ber vê yekê reaksîyon dikare li germahiyên ji normal 37-42℃ bilindtir were kirin.Di bin şert û mercên senteza pêşniyarkirî de, primerên oligo(dT) û 10μCi [alpha-p]dCTP hatin bikar anîn.Hilberîna tevahî ya zincîra yekem bi karanîna rêbaza baranê ya TCA hate hesibandin.CDNA-ya tev-dirêj bi karanîna rakirina tîrêjê bi mezinahî û jimartina di jelek agarose ya alkalîn de hate analîz kirin.

3. Germahiya parastina germê ya veguherîna berevajî zêde bikin:

Germahiya girtina bilind arîkariya vekirina avahiya duyemîn a RNA dike û hilberîna reaksiyonê zêde dike.Ji bo piraniya şablonên RNA, girtina ARN û primerê li 65°C bêyî tampon an xwê û dûv re zû sarkirina wan li ser berfê piraniya strukturên duyemîn ji holê radike û rê dide ku primer bi hev ve girêbidin.Lêbelê, hin şablon hîn jî xwedan avahiya duyemîn in, tewra piştî denaturasyona termal.Zêdekirina van şablonên dijwar dikare bi karanîna ThermoScript transkrîptaza berevajîkirî û bi danîna reaksiyona transkrîptaza berevajî li germahiyên bilindtir were kirin da ku zêdekirin baştir bibe.Germahiya bilindtir girtina her weha dikare taybetmendiyê zêde bike, nemaze dema ku senteza cDNA bi karanîna primerên gen-taybetî (GSPS) tê kirin (binihêre Beşa 3).Ger GSP bikar bînin, pê ewle bin ku nirxa Tm ya primerê wekî germahiya ku tê xwestin e.Li jor 60℃ oligo(dT) û primerên rasthatî bikar neynin.Pêdivî ye ku primerên rasthatî 10 hûrdem di 25℃ de bêne girtin berî ku 60℃ zêde bibin.Digel bikaranîna germahiyên bilindtir ên veguheztina berevajî, taybetmendî dikare bi rasterast veguheztina tevliheviya RNA/primer ji germahiya 65℃ denaturing berbi germahiya hilgirtina veguheztina berevajî ve û lê zêdekirina tevliheviyek reaksiyonê ya 2× ya pêş-germkirî (senteza destpêkirina termal a cDNA) were çêtir kirin.Ev nêzîkatî dibe alîkar ku pêşî li berhevkirina bingeha navmolekularî ya ku di germahiyên kêmtir de çêdibe.Bikaranîna amûrek PCR gelek guheztinên germahiyê yên ku ji bo RT-PCR hewce ne hêsan dike.

Polymeraza stabîlkirî ya germê di hebûna Mg2+ û RNA polîmerazê de di hebûna Mn2+ de wekî ADN-polymerase tevdigere.Ew dikare heya 65℃ germê bigire.Lêbelê, hebûna Mn2+ di dema PCR de dilsoziyê kêm dike, ku Tth polymerase ji bo zêdekirina rastbûna bilind, wek klonkirina cDNA, kêmtir guncantir dike.Wekî din, Tth di veguheztina berevajî de kêmtir bikêr e, ku hesasiyetê kêm dike, û ji ber ku enzîmek yekane dikare veguheztina berevajî û PCR-ê pêk bîne, reaksiyonên kontrolê bêyî veguheztina berevajî nikare were bikar anîn da ku hilberên zêdekirî yên cDNA ji yên DNA-ya genomîk a qirêj cuda bike.

4. Zêdekirina ku veguhertina berevajî pêşve dike:

Zêdekirina pêvekan, di nav de glycerin û DMSO, di reaksiyona senteza zincîra yekem de dikare aramiya zincîra dualî ya asîdê ya nukleîk kêm bike û avahiya duyemîn a RNA-yê ji holê rake.Heta 20% glycerin an 10% DMSO dikare bêyî bandorkirina çalakiya SuperScriptⅡ an MMLV were zêdekirin.AMV di heman demê de bêyî kêmkirina çalakiyê dikare heya 20% glycerol jî tehemûl bike.Ji bo zêdekirina hestiyariya RT-PCR di reaksiyona veguheztina berevajî ya SuperScriptⅡ de, 10% glycerol dikare were zêdekirin û di 45℃ de were îzole kirin.Ger 1/10 ji hilbera retrotranskripsiyonê-reaksiyonê li PCR-ê were zêdekirin, giraniya glycerol di reaksiyona zêdekirinê de %0,4 e, ku ji bo astengkirina PCR ne bes e.

5. Pêvajoya RNaseH:

Hesasiyet dikare bi dermankirina reaksiyonên senteza cDNA bi RNaseH berî PCR were baştir kirin.Ji bo hin şablonan, tê fikirîn ku RNA di reaksiyona senteza cDNA de pêşî li girêdana hilberên zêdekirî digire, di vê rewşê de dermankirina RNaseH dikare hestiyariyê zêde bike.Bi gelemperî, tedawiya RNaseH ji bo zêdekirina şablonek cDNA-ya hedefa dirêj-dirêj a nisbeten dirêj, wek scherosis tuberousⅡ bi kopiyek kêm hewce ye.Ji bo vê şablonê dijwar, RNaseH sînyala ku ji hêla cDNA ve hatî çêkirin ji hêla SuperScriptⅡ an AMV ve hatî çêkirin zêde kir.Ji bo piraniya reaksiyonên RT-PCR, dermankirina RNaseH vebijarkî ye ji ber ku qonaxa denaturasyona PCR ya 95℃ îzolekirî bi gelemperî RNA ji RNA: kompleksa DNA hîdrolîz dike.

6. Rêbazên çêtir ên ji bo tespîtkirina mîqdarên piçûk ên RNA:

RT-PCR bi taybetî dijwar e dema ku tenê mîqdarên piçûk ên RNA hene.Zêdekirina glycogenê wekî hilgirê di dema veqetandina RNA de dibe alîkar ku hilberîna nimûneyên piçûk zêde bibe.Glîkojenek bê RNase dikare di heman demê de wekî Trizol were zêdekirin.Glîkojen di avê de çareser dibe û dikare bi RNA re di qonaxa avê de bimîne da ku di barîna paşîn de bibe alîkar.Pîvana pêşniyarkirî ya glycogenê ya bê RNase 250 μg / ml ji bo nimûneyên kêmtir ji 50 mg ji tevnvîsê an 106 şaneyên çandî.

Zêdekirina BSA-ya acetylated ji bo berevajîkirina reaksiyonên transkriptasyonê bi karanîna SuperScriptⅡ dikare hestiyariyê zêde bike, û ji bo mîqdarên piçûk ên RNA, kêmkirina mîqdara SuperScriptⅡ û lê zêdekirina 40 yekîneyên frensa nukleazê RnaseOut dikare asta tespîtê baştir bike.Ger glycogen di veqetandina RNA de were bikar anîn, lê zêdekirina înhîbîtorên BSA an RNase ji bo berevajîkirina reaksiyonên transkripsiyonê bi karanîna SuperScriptⅡ hîn jî tê pêşniyar kirin.

Ⅱ. Taybetmendiya RT-PCR zêde bikin

1. senteza cNDA:

Sê rêbazên cihêreng dikarin ji bo destpêkirina senteza cDNA ya stûna yekem were bikar anîn, û taybetmendiya têkildar a her rêbazê bandorê li ser mîqdar û celebê cDNA-ya hatî çêkirin dike.

Rêbaza destpêkê ya rasthatî ji van sê rêbazan ya herî hindik taybetî ye.Primer li gelek cihan li seranserê transkrîptê têne şilandin da ku cDNA-ya kurt, dirêjahiya qismî hilberînin.Ev rêbaz bi gelemperî ji bo bidestxistina rêzikên termînalê yên 5' û cDNA ji şablonên RNA yên bi herêmên avahîsaziya duyemîn an jî bi cihên bidawîbûnê yên ku transkrîptaza berevajîkirî nikare dubare bibe tê bikar anîn.Ji bo bidestxistina cDNA ya herî dirêj, pêdivî ye ku di her nimûneya ARNyê de rêjeya primera bi ARNyê bi awayekî empirîkî were destnîşankirin.Pîvana destpêkê ya primerên rasthatî ji 50 heta 250ng per pergala reaksiyonê ya 20 μl diguhere.Ji ber ku cDNA-ya ku ji ARN-ya tevayî bi karanîna prîmerên rasthatî tê sentez kirin bi gelemperî RNA rîbozomî ye, bi gelemperî poly(A)+RNA wekî şablon tê hilbijartin.

Destpêka Oligo(dT) ji primerên rasthatî taybetîtir e.Ew bi dûvika polî(A) ya ku li dawiya 3' ya mRNAyê di piraniya şaneyên eukaryotî de tê dîtin, hîbrîdîze dibe.Ji ber ku poly(A)+RNA bi qasî 1% û 2% ji RNA tevahî ye, mîqdar û tevliheviya cDNA ji ya ku primerên rasthatî hatine bikar anîn pir kêmtir e.Ji ber taybetmendiya wê ya bilind, oligo(dT) bi gelemperî ji bo rêjeya RNA berbi primerê û hilbijartina polî(A)+ xweşbîniyê hewce nake.Tê pêşniyar kirin ku di pergala reaksiyonê ya 20 μl de 0.5μg oligo(dT) bikar bînin.oligo (dT) 12-18 ji bo piraniya RT-PCR-ê maqûl e.Pergala ThermoScript RT-PCR oligo(dT)20 peyda dike ji ber îstîqrara wê ya germî ya baş û ji bo germahiyên bilind ên ragirtinê maqûl e.

Destpêkên genê-taybetî (GSP) ji bo gavê veguheztina berevajî primerên taybetî yên çêtirîn in.GSP oligonukleozîdek antîsens e ku dikare bi taybetî bi rêzikên mebesta ARNyê re hîbrîdîze bibe, li şûna ku hemî Rnas mîna primerên rasthatî an oligo(dT) bişewitîne.Rêzikên ku ji bo sêwirana primerên PCR têne bikar anîn ji bo sêwirana reaksiyona veguheztina berevajî GSP jî derbas dibin.GSP dikare bibe heman rêzika ku amplîfîkasyonê ya ku di dawiya mRNA3' de tê çewisandin, an jî GSP dikare were sêwirandin da ku li jêr bi amplîfîkasyona berevajî ve were çewandin.Ji bo hin tiştên zêdekirî, pêdivî ye ku ji bo RT-PCR-ya serketî ji yekê zêdetir destpêkek antîsens were sêwirandin ji ber ku avahiya duyemîn a RNA-ya armanc dibe ku pêşî li girêdana primer bigire.Tête pêşniyar kirin ku di pergala reaksiyona senteza zincîra yekem a 20 μl de 1pmol antîsense GSP bikar bînin.

2. Germahiya parastina germê ya veguherîna berevajî zêde bikin:

Ji bo ku hûn bi tevahî ji taybetmendiya GSP-ê sûd werbigirin, divê transkriptaza berevajî ya bi aramiya germî ya bilind were bikar anîn.Transkriptaza berevajî ya germ-stable dikare di germahiyên bilind de were îzole kirin da ku hişkiya reaksiyonê zêde bike.Mînakî, heke GSP di 55°C de were çewisandin, wê hingê taybetmendiya GSP bi tevahî nayê bikar anîn ger veguheztina berevajî li 37 °C bi hişkiya kêm bi karanîna AMV an M-MLV were kirin.Lêbelê, SuperScripⅡ û ThermoScript dikarin li 50℃ an jî bilindtir reaksiyon bikin, ku hilberên netaybetî yên ku di germahiyên kêmtir de têne hilberandin ji holê radike.Ji bo taybetmendiya herî zêde, tevliheviya RNA/primer dikare rasterast ji germahiya denaturasyonê ya 65 ℃ veguhezîne germahiya hilgirtina veguheztina berevajî bi lêzêdekirina tevliheviyek reaksiyonê ya 2 x a pêş-germkirî (destpêkirina termal a senteza cDNA).Ev di germahiyên nizm de dibe alîkar ku pêşî li berhevkirina bingehê di navbera molekulan de bigire.Bikaranîna amûrek PCR gelek veguherînên germahiyê yên ku ji bo RT-PCR hewce ne hêsan dike.

3. Kêmkirina qirêjiya DNA ya genomîk:

Zehmetiyek potansiyel a bi RT-PCR re ev e ku RNA ADN-ya genomîk qirêj dike.Bikaranîna rêbazên çêtirîn veqetandina RNA, wekî Trizol Reagent, di amadekariyên RNA de gemariya DNA ya genomîk kêm dike.Ji bo nehiştina hilberên ku ji DNA-ya genomîk têne hilberandin, RNA dikare bi pola zêdekirina DnasⅠ were derman kirin da ku ADN-ya gemarî berî veguheztina berevajî were rakirin.Nimûne li 65℃ di 2.0mM EDTA de ji bo 10 hûrdeman hatin hilanîn da ku digestiya DNaseⅠ bi dawî bibe.EDTA îyonên magnesiumê kelate dike da ku pêşî li hîdrolîza RNA ya girêdayî îyona magnezyûmê bigire ku di germahiyên bilind de pêk tê.

Ji bo ku cDNA-ya zêdekirî ji hilbera zêdekirina DNA ya genomê were veqetandin, primerên ku bi eksona veqetandî veqetandî veqetandî têne sêwirandin.Berhemên PCR yên ku ji cDNA-yê têne wergirtin dê ji yên ku ji DNA-ya genomîk a gemarî têne peyda kirin kurttir bin.Ezmûnek kontrolkirî bêyî veguheztina berevajî jî li ser her şablonek RNA tête kirin da ku were destnîşankirin ka parçeyek diyar ji DNA ya genomîk an cDNA ye.Berhemên PCR yên ku di nebûna veguheztina berevajî de têne wergirtin ji genomê têne wergirtin.

Hilbera têkildar

RT-PCR hêsan^ᵀᴹEz (Yek Gav)

-Kiteya yek-gavekî dihêle ku veguheztina berevajî û PCR di heman boriyê de were kirin.Tenê pêdivî ye ku RNA-ya şablonê, primerên PCR-ya taybetî û ddH-ya Bê-RNase lê zêde bike.₂O.

-Analîzasyona mîqdar a RNA-yê di wextê rast de dikare zû û rast were kirin.

-Kit reagentek veguheztina berevajîkirî ya Foregene û Foregene HotStar Taq DNA Polymerase bi pergalek reaksiyonê ya bêhempa ve tê bikar anîn da ku bi bandor karîgerî û taybetmendiya reaksiyonê baştir bike.

-Pergala reaksiyonê ya xweşbîn dike ku reaksiyonê xwedan hestiyariya tespîta bilind, aramiya germî ya bihêztir, û tolerasyona çêtir e.

RT Easy II (Bi GDNase) Master Premix Ji bo Senteza CDNA ya Yekem Ji Bo PCR-ya Rastî Bi GDNase

-Qanûna bikêrhatî ya rakirina gDNA, ku dikare di nav 2 hûrdeman de gDNA di şablonê de jê bibe.

-Pergala veguheztina berevajî ya bi bandor, ew tenê 15 hûrdeman digire da ku senteza cDNA-ya stûna yekem temam bike.

-Şablonên tevlihev: şablonên bi naveroka GC-ya bilind û strukturên navîn ên tevlihev jî dikarin bi karbidestiya bilind berevajî bibin.

-Pergala veguheztina berevajî ya bi hesasiya bilind, şablonên asta pg jî dikarin cDNA-ya kalîteya bilind bistînin.

-Pergala veguheztina berevajî xwedan îstîqrara germî ya bilind e, germahiya reaksiyonê ya çêtirîn 42℃ e, û hîn jî di 50℃ de performansa veguheztina berevajî ya baş heye.