Fluorescence quantitative PCR (ku wekî TaqMan PCR jî tê zanîn, ji vir şûnde wekî FQ-PCR tê binav kirin) teknolojiyek nû ya mîqdar a asîda nukleîk e ku ji hêla PE (Perkin Elmer) ve li Dewletên Yekbûyî di sala 1995-an de hatî pêşve xistin.Li gorî PCR-ya maqûl, FQ-PCR gelek avantajên xwe hene ku fonksiyona xweya mîqdarî bicîh bîne.Ev gotar dixwaze ku bi kurtasî taybetmendî, prensîb, rêbaz û sepanên teknolojiyê rave bike.
1 Taybetmendî
FQ-PCR ne tenê xwedan hestiyariya bilind a PCR-ya asayî ye, lê di heman demê de ji ber serîlêdana sondajên fluorescentê, ew dikare rasterast guhertina sînyala fluorescentê di dema zêdekirina PCR-ê de bi navgîniya pergala hilgirtina fotoelektrîkî vedîtîne da ku encamên mîqdar bi dest bixe, ku gelek kêmasiyên PCR-ya kevneşopî derbas dike, ji ber vê yekê ew di heman demê de xwedan taybetmendiya bilind a teknolojiyên bilind ên DNA-yê ye.
Mînakî, hilberên PCR-ê yên gelemperî hewce ne ku bi elektroforezkirina gel agarose û rengkirina etidyum bromide bi ronahiya ultraviyole an bi elektroforezkirina gel a polacrylamide û rengkirina zîv werin temaşe kirin.Ev ne tenê gelek amûran hewce dike, lê di heman demê de dem û hewldanê jî digire.Reqên ku têne bikar anîn Ethidium bromide ji laşê mirovî re zirardar e, û van prosedurên ceribandinê yên tevlihev fersendên qirêj û erênîyên derewîn peyda dikin.Lêbelê, FQ-PCR tenê hewce dike ku di dema barkirina nimûneyê de carekê qapaxê veke, û pêvajoya paşîn bi tevahî operasyona lûleyê girtî ye, ku hewcedariya paşîn-pêvajoya PCR-ê nake, di operasyonên PCR-ya kevneşopî de ji gelek kêmasiyan dûr dikeve.Ezmûn bi gelemperî çerxa germî ya ABI7100 PCR ku ji hêla pargîdaniya PE ve hatî pêşve xistin bikar tîne.
Amûr xwedan taybetmendiyên jêrîn e: ① Serîlêdana berfireh: Ew dikare ji bo pîvandina hilbera DNA û RNA PCR, lêkolîna vegotina genê, tespîtkirina pathogen, û xweşbînkirina şert û mercên PCR were bikar anîn.② Prensîba mîqdar a yekta: Bi karanîna sondajên bi etîketkirî yên fluorescentî, dê mîqdara fluorescentê bi çerxa PCR-ê re piştî heyecana lazerê kom bibe, da ku bigihîje armanca hejmartinê.③ Karbidestiya xebatê ya bilind: Çêkera germî ya 9600 PCR-ya çêkirî, komputer 1 heya 2 demjimêran tê kontrol kirin da ku zêdekirin û hejmartina 96 nimûneyan bixweber û hevdemî temam bike.④ Ne hewce ye ji bo elektroforeziya gel: Ne hewce ye ku nimûneyê bişewitînin û elektroforez bikin, tenê lêkolînek taybetî bikar bînin da ku rasterast di lûleya reaksiyonê de tespît bikin.⑤ Di boriyê de gemarî tune: Tuba reaksiyonê ya bêkêmasî ya girtî û pergala hilgirtina fotoelektrîkê têne pejirandin, ji ber vê yekê ne hewce ye ku meriv ji qirêjiyê xeman bike.⑥ Encam ji nû ve têne hilberandin: Rêjeya dînamîkî ya hêjmarî heya pênc rêzikên mezinbûnê ye.Ji ber vê yekê, ji ber ku ev teknolojî bi serfirazî hate pêşve xistin, ji hêla gelek lêkolînerên zanistî ve hatî nirxandin û di gelek qadan de hate sepandin.
2 Prensîb û rêbaz
Prensîba xebatê ya FQ-PCR ev e ku meriv çalakiya 5'→3' exonuclease ya enzîma Taq bikar bîne da ku lêvegerek bi etîketa fluorescentî li pergala reaksiyona PCR zêde bike.Lêpirsîn dikare bi taybetî bi şablona ADNyê ya ku di rêzika pêşîn de heye re hîbrîdîze bibe.5'dawiya sondajê bi gena belavbûna floransê FAM (6-karboksîfluoresceîn, lûtkeya belavbûna floransê li 518nm) û ya 3'ya dawî bi koma vemirandina floransê TAMRA (6-karboksîtetramethylrhodaminesence2, 6-carboxytetramethylrhodamine5), tê nîşankirin, sondajê tê fosforîle kirin da ku pêşî li dirêjkirina sondajê di dema zêdekirina PCR de bigire.Dema ku sonda sax dimîne, koma quncher emîsyona floransê ya koma ku belav dike ditepisîne.Dema ku koma empandî ji koma qunçkirinê tê veqetandin, astengî tê rakirin, û dendika optîkî ya li 518nm zêde dibe û ji hêla pergala vedîtina floransê ve tê tesbît kirin. Di qonaxa vegerandinê de, sondaj bi DNA-ya şablonê re hîbrîdîze dibe, û enzîma Taq di qonaxa şablonê ya dirêjkirinê de bi dirêjkirina DNAyê re dimeşe.Dema ku sondajê qut dibe, bandora qunçkirinê derdikeve û sînyala fluorescentê derdikeve.Her gava ku şablon tê kopî kirin, sondayek tê qut kirin, digel berdana sînyalek floransent.Ji ber ku têkiliyek yek-bi-yek di navbera hejmara fluorophoreyên berdan û hejmara hilberên PCR-ê de heye, ev teknîk dikare were bikar anîn da ku şablonê rast bihejmêre.Amûra ceribandinê bi gelemperî çerxa germî ya ABI7100 PCR ku ji hêla pargîdaniya PE ve hatî pêşve xistin bikar tîne, û gerîdeyên din ên termal jî dikarin werin bikar anîn.Ger ji bo ceribandinê pergala reaksiyonê ya celebê reaksiyonê ABI7700 were bikar anîn, piştî ku reaksiyonê qediya, encamên mîqdar rasterast bi analîza komputerê ve têne dayîn.Heke hûn germkerên din bikar bînin, hûn hewce ne ku detektorek floransê bikar bînin da ku di heman demê de nîşana floransê di lûleya reaksiyonê de bipîvin da ku RQ+, RQ-, △RQ bihesibînin.RQ+ rêjeya ronahiya ronahiyê ya koma emîsyona floransê ya lûleya nimûneyê li hember tundiya ronahiyê ya koma qunçkirinê nîşan dide, RQ- rêjeya her duyan di lûleya vala de nîşan dide, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-Piştî guheztina daneya îşaretê-) dikare were bidestxistin.Ji ber danasîna sondajên fluorescent, taybetmendiya ceribandinê bi girîngî çêtir dibe.Sêwirana sondayê bi gelemperî divê şertên jêrîn bicîh bîne: ① Dirêjahiya sondayê divê bi qasî 20-40 bingeh be da ku taybetmendiya girêdanê piştrast bike.②Naveroka bazên GC di navbera 40% û 60% de ye ku ji dubarekirina rêzikên yek nucleotide dûr nekevin.③ Xwe ji hîbrîdîzasyon an jî bi aşîkeran re hevûdu dûr bixin.④ Îstîqrara girêdana di navbera sondajê û şablonê de ji aramiya girêdana di navbera aşîkar û şablonê de mezintir e, ji ber vê yekê nirxa Tm ya sondayê divê herî kêm 5°C ji nirxa Tm ya primerê bilindtir be.Wekî din, hûrbûna sondajê, homolojiya di navbera sondajê û rêzika şablonê de, û dûrahiya di navbera sondajê û primerê de hemî bandorek li ser encamên ceribandinê dikin.
Berhemên têkildar:
Çîn Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman Çêker û Pêşkêşkar |Foregene (foreivd.com)
Dema şandinê: Oct-15-2021
