Di ceribandinên qPCR de, sêwirana primer jî girêdanek pir girîng e.Ka primers guncaw in an na, ji nêz ve girêdayî ye ka gelo karbidestiya zêdekirinê digihîje standardê, gelo hilberên zêdekirî taybetî ne, û gelo encamên ceribandinê hene.
Ji ber vê yekê meriv çawa taybetmendiya primera qPCR çêtir dike?Karbidestiya zêdekirina bilind?
Îro, em ê we bixin ku hûn bi hev re primerên qPCR dîzayn bikin, û bihêlin ku sêwirana primera qPCR di ceribandinan de bibe jêhatîbûnek jêhatî ya jêhatî.
Dema dîzaynkirina primerên qPCR, bi gelemperî bala xwe bidin xalên jêrîn: divê primers bi qasî ku gengaz be li seranserê întronan bêne sêwirandin, dirêjahiya hilberê 100-300 bp be, nirxa Tm bi qasî ku gengaz dibe nêzî 60 ° C be, û aşîkarên jorîn û jêrîn divê bi qasî ku pêkan nêzîk bin, û dawiya primerê divê li benda G an C be û hwd.
1. Sêwirana primerên ku intronan vedigirin
Dema sêwirana prîmerên qPCR, hilbijartina primerên ku li seranserê intronan hatine sêwirandin dikare pêşî li zêdekirina şablonê gDNA bigire, û hilber hemî ji zêdekirina cDNA-yê têne wergirtin, bi vî rengî bandora gemariya gDNA ji holê radike.
2. Dirêjahiya Primer
Dirêjahiya primerê bi gelemperî di navbera 18-30 nt de ye, û dirêjahiya hilbera zêdekirinê divê heya ku gengaz be di navbera 100-300 bp de were kontrol kirin.
Ger primer pir kurt be, ew ê bibe sedema zêdekirina ne-taybetî, û heke ew pir dirêj be, ew ê bi hêsanî strukturek duyemîn çêbike (wek strukturên porê).Ger hilbera amplifikasyonê pir dirêj be, ew ji bo reaksiyona polîmerazê ne maqûl e, ku dê bandorê li ser karîgeriya zêdekirina PCR bike.
3. Naveroka GC û nirxa Tm
Divê naveroka GC ya primers di navbera 40% û 60% de were kontrol kirin.Ger ew pir zêde be an jî pir kêm be, ji bo destpêkirina reaksiyonê ne guncan e.Naveroka GC ya primerên pêşeroj û berevajî divê nêzî hev be da ku heman nirxa Tm û germahiya lêdanê bi dest bixe.
Pêdivî ye ku nirxa Tm di navbera 55-65 ° C de heya ku gengaz be, bi gelemperî li dora 60 ° C be, û nirxa Tm ya jorîn û jêrîn divê bi qasî ku gengaz nêzîk be, çêtir e ku ji 4 °C zêdetir nebe.
4. Ji bijartina A-yê li dawiya 3'ya primerê dûr bixin
Dema ku dawiya 3 'ya primerê nehevhatî be, cûdahiyên mezin di kargêriya senteza bingehên cihêreng de hene.Dema ku bingeha paşîn A ye, ew dikare di heman demê de di rewşa nehevhevkirinê de jî senteza zincîrê bide destpêkirin, û gava ku bingeha paşîn T be Dema ku, karbidestiya înduksiyona nelihevkirinê pir kêm dibe.Ji ber vê yekê, hewl bidin ku ji hilbijartina A-yê li dawiya 3'ya primerê dûr bisekinin, û çêtir e ku meriv T-yê hilbijêrin.
Ger ew primera sondajê be, dawiya 5' ya sondajê nikare bibe G, ji ber ku tewra gava yek bingehek G bi koma nûçegihana fluorescentê ya FAM-ê ve were girêdan, G dikare îşareta floransê ya ku ji hêla koma FAM ve hatî weşandin jî bitemirîne, û di encamê de encamên neyînî yên derewîn derkeve.Xûyabûn.
5. Dabeşkirina bingehîn
Dabeşkirina çar bingehên di primerê de bi tercîh bêserûber e, ji 3'yê zêdetir G an C li dû hev di dawiya 3' de, û ji 3 li pey hev bêtir dûr dikeve.G an C hêsan e ku meriv li herêma rêza dewlemend a GC-ê cotê çêbike.
6. Divê devera sêwirana pêşîner ji strukturên navîn ên tevlihev dûr bixe.
Struktura duyemîn a ku ji hêla yekane ya hilbera amplifikasyonê ve hatî çêkirin dê bandorê li pêşkeftina bêkêmasî ya PCR bike.Bi pêşbînîkirina ka di rêza armancê de avahiyek duyemîn heye an na, hewl bidin ku di sêwirana primmeran de ji vê herêmê dûr bikevin.
7. Divê primerên xwe û di navbera primareyan de hewl bidin ku xwe ji bingehên temamker ên li pey hev dûr bixin.
Di navbera primera xwe û primerê de temamkeriya 4 bingehê ya li pey hev nikare hebe.Pêdivî ye ku abek bi xwe xwedan rêzek temamker nebe, wekî din ew ê xwe biqewitîne da ku avahiyek porê çêbike, ku dê bandorê li hevberdana annealkirina aşît û şablonê bike.
Rêzên temamker nikarin di navbera primerên jorîn û jêrîn de hebin.Tevhevbûna di navbera primeran de dê dimerên primer hilberîne, ku dê karbidestiya PCR kêm bike û tewra bandorê li rastbûna mîqdar jî bike.Ger strukturên primer-dimer û porê neçar bin, divê nirxa △G ne pir zêde be (divê ji 4,5 kcal/mol kêmtir be).
8. Pêşker hilbera taybetî ya armancê zêde dikin.
Armanca dawîn a tespîtkirina qPCR ev e ku meriv pirbûna genê armancê fam bike.Ger zêdekirina ne-taybetî çêbibe, dê hejmarkirin nerast be.Ji ber vê yekê, piştî ku primers têne sêwirandin, pêdivî ye ku ew ji hêla BLAST ve werin ceribandin, û taybetmendiya hilberan di databasa rêzan de tê berhev kirin.
Dûv re, em gena mirovî GAS6 (Growth girtina taybetî 6) wekî mînakek ji bo sêwirana primerên qPCR digirin.
01 genê pirsê
Homo GAS6bi rêya NCBI.Li vir, divê em bala xwe bidin berhevdana nav û celebên genê da ku pê ewle bin ku ew hevgirtî ne.
02 Rêza genê bibîne
(1) Heke rêzika armanc DNA-ya genomîk e, ya yekem hilbijêrin, ku rêzika ADN-ya genomîkî ya genê ye.
(2) Heke rêzika armanc mRNA be, ya duyemîn hilbijêrin.Piştî têketinê, di tabloya jêrîn de "CDS" bikirtînin.Rêza paşpirtika qehweyî rêzika kodkirina genê ye.
03 primers Design
Têkeve navrûya Primer-BLAST
Li milê çepê yê jorîn jimareya rêza genê an rêzika bi formata Fasta binivîse, û pîvanên têkildar dagirin.

Bikirtînin "Get primers" û NCBI dê derkeve holê ku ji we re vebêje ku bijartina vî rengî dê li guhertoyên din ên dabeşkirinê were zêdekirin.Em dikarin cûrbecûr guheztinên cihêreng kontrol bikin û wan radest bikin da ku cotek pêşîn a guncan bistînin (wek ku di wêneya jêrîn de tê xuyang kirin).Dibe ku ev pêvajo bi deh saniyan bidome.
Germahiya lêdanê ya van cotên primerê li dora 60°C ye.Li gorî armanca azmûnê, ji bo ceribandinê primerên bi dirêjahiya nerm, taybetmendiya baş û kêm xwe-temamkirina primers hilbijêrin, û rêjeya serkeftinê pir zêde ye!
04 Verastkirina taybetmendiya Primer
Bi rastî, ji bilî sêwirana primers, Primer-Blast dikare primerên ku me bixwe sêwirandî jî binirxîne.Vegerin ser rûpela sêwirana aşîkarê, bikevin navberên jorîn û jêrîn ên ku me sêwirandine, û pîvanên din dê neyên sererast kirin.Piştî radestkirinê, hûn dikarin bibînin ka cotê destpêk li ser genên din jî hene.Ger ew hemî li ser gena ku em dixwazin zêde bikin têne xuyang kirin, ev destnîşan dike ku taybetmendiya vê cotê primera mezin e!(Mînakî, ev yek tenê encama lêpirsîna destpêkê ye!)

05 Dadweriya kalîteya Primer
Destpêka "bêkêmasî" ya ku "berbiçavbûna zêdekirinê ya li gorî standard", "taybetmendiyên hilbera zêdekirî", û "encamên ceribandinê yên pêbawer" li hev dike, çi celeb arîmer e?
Karbidestiya Amplification

keleka helandinê
Berbiçavkirina zêdekirina primmeran digihîje% 90% -110, ku tê vê wateyê ku karbidestiya zêdekirinê baş e, û keviya helandinê lûtkeyek yekane heye û bi gelemperî Tm> 80°C, ku tê vê wateyê ku taybetmendiya zêdekirinê baş e.
 
Berhemên Têkildar:
Wextê rastîn PCR Easy–SYBR GREEN I
Real Time PCR Easy-Taqman