Teknolojiya teşhîsa molekularî rêbazên biyolojiya molekulî bikar tîne da ku îfade û avahiya materyalê genetîkî ya laşê mirov û pathogenên cihêreng bibîne, da ku bigihîje mebesta pêşbînîkirin û teşhîskirina nexweşiyan.

Di salên dawî de, bi nûvekirin û dubarekirina teknolojiya tespîtkirina molekulî re, serîlêdana klînîkî ya tespîtkirina molekulî her ku diçe berfireh û kûrtir bûye, û bazara tespîtkirina molekulî ketiye serdemek pêşkeftina bilez.

Nivîskar teknolojiyên tespîtkirina molekulî yên hevpar ên li ser sûkê kurt dike, û li sê beşan tê dabeş kirin: beşa yekem teknolojiya PCR destnîşan dike, beşa duyemîn teknolojiya zêdekirina isotermal a asîdê ya nukleîk, û beşa duyemîn teknolojiya rêzgirtinê destnîşan dike.

01

Beş I: Teknolojiya PCR

Teknolojiya PCR

PCR (reaksiyona zincîra polîmerazê) yek ji teknolojiyên zêdekirina DNA ya in vitro ye, ku ji 30 salan zêdetir dîrokek wê heye.

Teknolojiya PCR di sala 1983-an de ji hêla Kary Mullis ya Cetus, USA ve hate pêşve xistin.Mullis di sala 1985-an de serlêdana patenta PCR kir û di heman salê de yekem kaxeza akademîk a PCR li ser Zanistê weşand.Mullis di sala 1993 de Xelata Nobelê ya Kîmyayê wergirt.

Prensîbên bingehîn ên PCR

PCR dikare perçeyên DNA yên armanc ji mîlyonek carî zêde bike.Prensîb ev e ku di bin katalîzasyona ADN-yê polîmerazê de, ADN-ya dêûbav wekî şablonek tê bikar anîn, û primera taybetî wekî xala destpêkê ya dirêjkirinê tê bikar anîn.Ew di vitro de bi gavên wekî denaturasyon, helandin, û dirêjkirinê tê dubare kirin.Pêvajoya ADN-ê ya keçikê ya ku bi ADN-ya şablonê stûna dêûbav re temam dike.

Pêvajoya PCR ya standard di sê gavan de dabeş dibe:

1. Denaturasyon: Germahiya bilind bikar bînin da ku xêzên ducarî yên ADNyê ji hev veqetînin.Girêdanên hîdrojenê yên di navbera rêzikên ducarî yên ADNyê de di germahiyên bilind (93-98°C) de têne şikandin.

2. Pîvankirin: Piştî ku ADN-ya dubendî ji hev tê veqetandin, germahî tê daxistin da ku primerê bi ADNya yek-zindî ve girêbide.

3. Zêdebûn: ADN polymerase dema ku germahî tê daxistin dest bi sentezkirina zincîreyên temamker ên li ser zincîreyên ADNyê ji primerên girêdayî dike.Dema ku dirêjkirin qediya, çerxek qediya, û hejmara perçeyên DNA du qat dibe.

Ger van her sê gavan 25-35 caran bizivirînin, dê hejmara perçeyên DNAyê qat bi qat zêde bibe.

Aqilmendiya PCR ev e ku primerên cihêreng dikarin ji bo genên mebestên cihêreng werin sêwirandin, da ku perçeyên genê armanc di demek kurt de werin zêdekirin.

Heya nuha, PCR dikare li sê kategoriyan were dabeş kirin, ango PCR-ya asayî, PCR-ya mîqdar a fluorescent û PCR-ya dîjîtal.

Nifşa yekem a PCR ya asayî

Amûrek zêdekirina PCR ya asayî bikar bînin da ku genê armanc zêde bikin, û dûv re elektroforeziya gel agarose bikar bînin da ku hilberê nas bikin, tenê analîzek kalîte dikare were kirin.

Dezawantajên sereke yên nifşa yekem PCR:

-Meyla zêdekirina ne-taybet û encamên erênî yên derewîn.

-Destpêkirin demek dirêj digire û operasyon jî giran e.

-Tenê ceribandina kalîteyê dikare were kirin.

PCR mîqdar a fluorescence nifşê duyemîn

PCR-ya mîqdar a fluorescentê (PCR-a-dema rast), ku wekî qPCR jî tê zanîn, ji bo şopandina berhevkirina hilberên zêdebûyî bi berhevkirina sînyalên floresentê ve tê bikar anîn û bi lêzêdekirina sondajên fluorescentê yên ku dikarin pêşkeftina pergala reaksiyonê destnîşan bikin, û dadbarkirina encaman bi riya keviya floransê, û bi alîkariya nirxa standard were pîvandin.

Ji ber ku teknolojiya qPCR di pergalek girtî de pêk tê, îhtîmala vegirtinê kêm dibe, û sînyala fluorescence dikare ji bo tespîtkirina mîqdar were şopandin, ji ber vê yekê ew di pratîka klînîkî de ya herî berfireh tê bikar anîn û di PCR de bûye teknolojiya serdest.

Madeyên fluorescentê yên ku di PCR-ya mîqdar a fluorescentê ya rast-a-time de têne bikar anîn dikarin li van dabeşan werin dabeş kirin: TaqMan sondajên floransent, tîrêjên molekulî û rengên floransent.

1) TaqMan sondaya fluorescent:

Di dema zêdekirina PCR-ê de, dema ku cotek primers lê zêde bike, sondayek fluorescentê ya taybetî tê zêdekirin.Lêpirsîn oligonukleotîdek e, û her du dawiya wan bi rêzê bi komek fluorescentê ya nûçegihan û komek fluorescentê quencher têne nîşankirin.

Dema ku sondaj saxlem be, sînyala floresentê ya ku ji hêla koma nûçegihanan ve hatî derxistin ji hêla koma quenching ve tê vegirtin;di dema zêdekirina PCR de, çalakiya 5'-3' exonukleazê ya enzîma Taq sondajê diqetîne û xera dike, koma fluorescentê ya nûçegîhanê dike û quncher dike. sînyala floransê bi pêkhatina hilbera PCR re bi tevahî hevdem e.

2) Rengên fluorescent SYBR:

Di pergala reaksiyonê ya PCR de, zêdeyî rengê SYBR fluorescent tê zêdekirin.Piştî ku boyaxa fluorescentê ya SYBR ne-taybetî di nav zencîra dualî ya ADNyê de tê bicîh kirin, ew îşaretek fluorescentê derdixe.Molekula boyaxa SYBR ya ku di zincîrê de nehêle dê ti îşaretek fluorescent dernexîne, bi vî rengî sînyala fluorescentê piştrast dike. Zêdebûna hilberên PCR bi zêdebûna hilberên PCR re bi tevahî hevdem e.SYBR tenê bi ADN-ya dubendî ve girêdide, ji ber vê yekê kêşeya helandinê dikare were bikar anîn da ku diyar bike ka reaksiyona PCR taybet e.

3) Çirayên molekular

Ew sondayek oligonukleotidî ya du-labelkirî ya stem-loop e ku li 5 û 3 dawîn avahiyek porê bi qasî 8 bingehan pêk tîne.Rêzên asîda nukleîk ên li her du aliyan bi hev re têne hev kirin, ku dibe sedema ku koma florescent û koma qunçing teng bibin.Nêzîkî, ew ê fluorescence hilberîne.

Piştî ku hilbera PCR-ê tê çêkirin, di dema pêvajoya helandinê de, beşa navîn a tîrêjê molekulî bi rêzek DNA ya taybetî re tête hev kirin, û gena fluorescent ji gena quncher tê veqetandin da ku floransê çêbike.

Dezawantajên sereke yên PCR-nifşa duyemîn:

Hesasiyet hîn jî kêm e, û tespîtkirina nimûneyên kêm-kopî ne rast e.

Bandora nirxa paşîn heye, û encam ji destwerdanê re gumanbar e.

Nifşa sêyemîn PCR dîjîtal

PCR dîjîtal (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) jimara kopî ya rêzika armancê bi vedîtina xala dawîn dihesibîne, û dikare bêyî karanîna kontrolên hundurîn û kelûpelên standard tespîtkirina mîqdar a bêkêmasî pêk bîne.

PCR dîjîtal tespîtkirina xala paşîn bikar tîne û bi nirxa Ct-yê ve girêdayî nîne (berbihaya çerxê), ji ber vê yekê reaksiyona PCR-ya dîjîtal ji hêla karbidestiya zêdekirinê kêmtir tê bandor kirin, û tolerasyona li hember astengkerên reaksiyona PCR, bi rastbûn û dubarebûnek bilind, çêtir dibe.

Ji ber taybetmendiyên hesasiyeta bilind û rastbûna bilind, ew bi hêsanî ji hêla astengkerên reaksiyonên PCR-ê ve nayê destwerdan, û ew dikare bêyî hilberên standard, ku bûye cîhek lêkolîn û serîlêdanê, pîvanek rastîn a rastîn bi dest bixe.

Li gorî formên cihêreng ên yekîneya reaksiyonê, ew dikare sê celeb were dabeş kirin: pergalên mîkrofluîdî, çîp û dilop.