Nirxa Ct forma herî girîng a pêşkêşkirina encamê ya PCR-ya mîqdar a fluorescent e.Ew ji bo hejmartina cûdahiyên îfadeya genê an jî hejmara kopiya genê tê bikar anîn.Ji ber vê yekê nirxa Ct ya mîqdarkirina floransê maqûl tê hesibandin çi ye?Meriv çawa rêjeya bandorker a nirxa Ct piştrast dike?
Nirxa Ct çi ye?
Di dema pêvajoya xurtkirina qPCR de, dema ku nîşana floransê ya hilbera zêdekirî digihîje berdêla floransê ya destnîşankirî, hejmara têkildar a çerxên zêdekirinê (Bîza Derdorê).C ji bo Cycle û T ji bo Threshold radiweste.Bi hêsanî, nirxa Ct hejmara çerxên ku dema ku zêdekirina şablonê destpêkê di qPCR de digihîje hindek hilberek e.Ya ku jê re tê gotin "hejmarek hilber" dê paşê bêtir were rave kirin.
Nirxa Ct çi dike?
1.Têkiliya di navbera zêdekirina berbiçav, mîqdara şablonê û nirxa Ct de
Bi îdeal, genên di qPCR de piştî hejmareke diyarkirî ya dewranan ji hêla zêdekirina berbiçav ve têne berhev kirin.Têkiliya di navbera hejmara çerxên zêdekirinê û hêjmara hilberan de ev e: Mîqdara hilbera zêdekirî = mîqdara şablonê ya destpêkê × (1+En) jimareya dewran.Lêbelê, reaksiyona qPCR ne her gav di rewşek îdeal de ye.Dema ku mîqdara hilbera zêdekirî digihîje "hejmarek hilberek diyar", di vê demê de hejmara çerxên nirxa Ct ye, û ew di heyama zêdekirina berbiçav de ye.Têkiliya di navbera nirxa Ct û mîqdara şablonê destpêk de: Têkiliyek rêzik di navbera nirxa Ct ya şablonê û logarîtma jimareya kopiya destpêkê ya şablonê de heye.Pîvana şablonê ya destpêkê çi qas bilindtir be, nirxa Ct ew qas piçûktir dibe;hûrbûna şablonê ya destpêkê kêm dibe, nirxa Ct mezintir e.
2. Kûçek amplification, sînorê fluorescence û hin mîqdara hilberê PCR
Mîqdara hilbera zêdekirina qPCR rasterast di forma nîşana fluorescentê de, ango, kêşeya amplificationê tê pêşkêş kirin.Di qonaxa destpêkê ya PCR de, zêdebûn di bin şert û mercên îdeal de ye, hejmara dewreyan piçûk e, berhevkirina hilberê piçûk e, û asta floransê bi zelalî ji paşxaneya floransê nayê cûda kirin.Piştî vê yekê, floransence zêde dibe û dikeve qonaxa berbiçav.Mîqdara hilbera PCR dikare di xalek diyarkirî de were tesbît kirin dema ku reaksiyona PCR tenê di qonaxa berbiçav de ye, ku dikare wekî "hejmarek hilberek" were bikar anîn, û naveroka destpêkê ya şablonê ji vê yekê were derxistin.Ji ber vê yekê, tîrêjiya nîşana floransê ya ku bi hêjmarek hilberek re têkildar e, sînorê floransê ye.
Di qonaxa dereng a PCR-ê de, kêşeya amplificationê nema zêdekirina berbiçav nîşan dide, û dikeve qonaxa rêzik û qonaxa deştê.
3.Reproducibility nirxên Ct
Dema ku çerxa PCR-ê digihîje jimareya çerxa nirxa Ct, ew nû ketiye heyama zêdekirina berbiçav a rastîn.Di vê demê de, xeletiya piçûk nehatiye zêdekirin, ji ber vê yekê dubarebûna nirxa Ct xweş e, ango heman şablon di demên cûda de an di heman demê de di lûleyên cûda de tê zêdekirin.Amplification, nirxa Ct ya ku tê wergirtin berdewam e.
1.Amplification efficiency En
Karbidestiya zêdekirina PCR-ê tê wateya karbidestiya ku bi wê polîmeraz genê ku were zêdekirin vediguhezîne amplikonek.Dema ku yek molekulek DNA veguherîne du molekulên ADN-ê, karbidestiya zêdekirinê %100 e.Berbiçavkirina zêdekirinê bi gelemperî wekî En tête diyar kirin.Ji bo hêsankirina analîzkirina gotarên paşerojê, faktorên ku bandorê li ser karîgeriya zêdekirinê dikin bi kurtî têne destnîşan kirin.
| Faktorên bandorker | daxûyanî | Meriv çawa dadbar dike? |
| A. PCR inhibitors | 1. ADN-ya şablonê madeyên ku reaksiyona PCR asteng dikin, wek proteîn an deterjantan dihewîne.2. CDNA ya piştî transkrîpsiyona berevajî raneke bilind a şablonê RNA an hêmanên reagentê yên RT dihewîne, ku ev jî dibe ku reaksiyona PCR ya paşîn asteng bike. | 1. Ger qirêjî heye, meriv dikare bi pîvandina rêjeya A260/A280 û A260/A230 an jî elektroforezên ARN-ê were darizandin.2. Ma cDNA li gorî rêjeyek diyar piştî transkrîpsiyona berevajî tê rijandin. |
| B. Sêwirana pêşîn a nerast | Primer bi rengek bikêr çênabin | Ji bo primmer-dimer an çîpên por, nelihevkirin, û carinan sêwiranên întronîkî yên primers kontrol bikin. |
| C. Sêwirana bernameya berteka PCR ya nerast | 1. Primer nikarin bi bandor nehêle2. Kêm berdana ADN polymerase 3. Çalakiya polîmerazê ya DNA ya germahiya dirêj a demdirêj kêm bû | 1. Germahiya annealing ji nirxa TM ya primer bilindtir e2. Dema berî denaturasyonê pir kurt e 3. Dema her qonaxa pêvajoya reaksiyonê pir dirêj e |
| D. Kêmasî tevlihevkirina reagentan an xeletiyên pipetkirinê | Di pergala reaksiyonê de, hûrbûna herêmî ya pêkhateyên reaksiyonê PCR pir zêde an nehevseng e, ku di encamê de zêdekirina ne-tevgerî ya zêdekirina PCR-ê ye. | |
| E. Dirêjahiya Amplicon | Dirêjahiya amplikonê pir dirêj e, ji 300bp zêdetir e, û kargêriya amplification kêm e | Kontrol bikin ku dirêjahiya amplicon di navbera 80-300bp de ye |
| F. Bandora reagentên qPCR | Di reagentê de giraniya DNA polîmerazê kêm e an jî giraniya îyonan di tamponê de ne xweşbîn e, di encamê de çalakiya enzîma Taq negihêje herî zêde. | Tesbîtkirina karbidestiya amplification ji hêla kêşeya standard |
2.Range nirxên Ct
Nirxên Ct di navbera 15-35 de ne.Ger nirxa Ct ji 15 kêmtir be, tê hesibandin ku zêdebûn di nav rêza heyama bingehîn de ye û sînorê floransê negihiştiye.Bi îdeal, di navbera nirxa Ct û logarîtmaya jimareya kopiya destpêkê ya şablonê de, ango kêşeya standard, têkiliyek rêzik heye.Di nav kêşa standard de, dema ku karbidestiya zêdekirinê 100% be, nirxa Ct-ya hesabkirî ya ji bo pîvandina hejmara kopiya yekane ya genê li dora 35 e. Ger ew ji 35 mezintir be, jimara kopiya destpêkê ya şablonê bi teorîkî ji 1 kêmtir e, ku dikare bêwate were hesibandin.
Ji bo rêzikên Ct-yê yên cihêreng, ji ber cûdahiya di hejmara kopiya genê de û bikêrhatina zêdekirina di mîqdara şablonê ya destpêkê de, pêdivî ye ku ji bo genê kelekek standard were çêkirin û rêza tespîtkirina rêzê ya genê were hesibandin.
3.Faktorên bandor ên nirxa Ct
Ji têkiliya di navbera hejmara çerxên zêdekirinê û mîqdara hilberê de: mîqdara hilbera zêdekirî = mîqdara şablonê destpêkê × (1+En) hejmara çerxê, tê dîtin ku di bin şert û mercên îdeal de, mîqdara şablonê destpêkê û En dê bandorek neyînî li ser nirxa Ct bike.Cûdahiya di qalîteya şablonê an karbidestiya zêdekirinê de dê bibe sedem ku nirxa Ct pir mezin an pir piçûk be.
Nirxa 4.Ct pir mezin an pir piçûk e
Dema şandinê: Feb-22-2023
