Real Time PCR, ku wekî PCR an qPCR jî tête zanîn, rêbazek ji bo şopandin û analîzkirina hilberên zêdekirina PCR-ê ye.
Ji ber ku PCR-ya mîqdar xwedan avantajên operasyona hêsan, zû û hêsan, hesasiyeta bilind, dubarebûna baş, û rêjeya gemarî ya kêm e, ew bi berfirehî di ceribandina bijîjkî, nirxandina bandoriya derman, lêkolîna derbirrîna genê, lêkolîna transgenîk, tespîtkirina genê, tespîtkirina pathogen, tespîtkirina heywan û nebatan de tê bikar anîn., ceribandina xwarinê û qadên din.
Ji ber vê yekê, gelo hûn di lêkolîna bingehîn de di zanistên jiyanê de, an xebatkarên pargîdaniyên derman, pargîdaniyên xwedîkirina heywanan, pargîdaniyên xwarinê, an jî tewra karmendên buroyên kontrolkirina ketin-derketinê û karantînayê, beşên çavdêriya jîngehê, nexweşxane û yekîneyên din mijûl dibin, hûn ê kêm-zêde rûbirû bibin An jî hûn hewce ne ku zanîna serweriya PCR-ya mîqdar zanibin.

Prensîba PCR-ya Real Time

Real Time PCR rêbazek e ku tê de maddeyên fluorescentê li pergala reaksiyona PCR-ê têne zêdekirin, û di pêvajoya reaksiyonê ya PCR de tundiya nîşana fluorescentê di demek rast de ji hêla amûrek PCR-ya mîqdar ve tê şopandin, û di dawiyê de daneyên ceribandinê têne analîz kirin û pêvajo kirin.

【Kûra amplification】kêşa pêvajoya dînamîk a PCR-ê ye.Kevirê zêdekirina PCR-ê bi rastî ne xêzek pêşangehek standard e, lê kelekek sigmoîd e.

[Qonaxa platformê ya kurba zêdekirinê]Bi zêdebûna hejmara çerxên PCR, neçalakkirina ADN polymerase, kêmbûna dNTP û primmeran, û astengkirina reaksiyona sentezê ji hêla pirofosfat-hilbera reaksiyonê, hwd., PCR her gav bi qasê berfireh nabe., û di dawiyê de dê bikeve deştek.

[Herêma Pêşveçûna Berbiçav ya Kûreya Pêvekirinê]Her çend qonaxa deştê pir diguhere jî, li herêmek diyar a herêma mezinbûna berfireyî ya keviya zêdebûnê, dubarebûn pir baş e, ku ji bo analîza mîqdar a PCR-ê pir girîng e.

[Nirxa tixûb û nirxa Ct]Me nirxa sînorî ya tespîtkirina floransê li cîhê guncan li qada mezinbûna pêşbirkê ya kevroşka mezinbûnê, ango nirxa tîrêjê (Threshold) destnîşan kir.Hevberdana nirxa behrê û kurba zêdekirinê nirxa Ct ye, ango nirxa Ct dema ku gihîştina nirxa boriyê vedibêje hejmara dewreyan (Threshold Cycle).

Grafika li jêr bi zelalî têkiliya di navbera xeta bordûmanê û kevroşka amplîfasyonê, tixûb û nirxa Ct de nîşan dide.

【Meriv çawa hejmartinê dike?】

Ji hêla teoriya matematîkî ve hatî îsbat kirin ku nirxa Ct bi logarîtma hejmara şablonên destpêkê re têkiliyek xêzek berevajî heye.Real Time PCR hilberên zêdekirina PCR-ê di wextê rast de dişopîne û wan di qonaxa mezinkirina berbiçav de hejmar dike.

Ji bo her çerxa PCR-ê, ADN bi qat bi qat 2 qatan zêde bû, û di demek kurt de gihîşt astekê.

Bihesibînin ku mîqdara DNA ya destpêkê A ye₀ , piştî n dewreyan, mîqdara teorîkî ya hilbera ADNyê dikare wiha were diyar kirin:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Dûv re, mîqdara DNA ya destpêkê A 0 çiqas bêtir be, hêjmara hilbera zêdekirî zûtir digihîje nirxa tespîtkirinê An, û hejmara çerxên dema ku digihîje An nirxa Ct ye.Ango, mîqdara DNA ya destpêkê A 0 çiqasî zêde be, ew qas zû lûtkeya qertafê zêde dibe, û bi vî rengî hejmara pêdiviya dewran n piçûktir e.

Em helandina gradientê ya standarda konsantasyona naskirî pêk tînin û wê wekî şablonek ji bo PCR-ya Real Time bikar tînin, û rêzek kelûpelên amplifikasyonê dê di navberên wekhev de bi rêza destpêkirina mîqdara DNA-yê ji pirtir û hindiktir werin bidestxistin.Li gorî têkiliya xêzikî ya di navbera nirxa Ct û logarîtmaya hejmara şablonên destpêkê de, a[kurva standard] dikare were afirandin.

Bi guheztina nirxa Ct ya nimûneyê ya bi konsantasyona nenas di kevza standard de, mîqdara şablonê ya destpêkê ya nimûneya bi giraniya nenas dikare were bidestxistin, ku ev prensîba mîqdar a Real Time PCR-ê ye.

Rêbaza tespîtkirina Real Time PCR

Real Time PCR hilberên zêdekirina PCR-ê bi tespîtkirina tundiya fluorescence di pergala reaksiyonê de vedigire.

Prensîba Methodê Têkelkirina Dye Fluorescent】

Rengên florescent, wek TB Green ®, dikare bi rengek netaybetî bi ADN-ya dubendî ya di pergalên PCR de ve girêbide û bi girêdanê re florans bike.

Di pergala reaksiyonê de bi zêdebûna çerxên PCR-ê re tîrêjiya floransê bi qat zêde zêde bû.Bi tespîtkirina tundiya floransê re, mîqdara zêdekirina ADN-ê di pergala reaksiyonê de dikare di wextê rast de were şopandin, û dûv re mîqdara şablona destpêkê ya di nimûneyê de berevajî were texmîn kirin.

【Prensîba rêbaza sondaya fluorescentê】

sondaya fluorescentRêzek asîdek nukleîk e ku komeke fluorescent li dawiya 5 'û komek qunçing li dawiya 3' ye, ku dikare bi taybetî bi şablonê ve girêbide.Dema ku sondaj saxlem be, fluoresansa ku ji hêla fluorophore ve hatî derxistin ji hêla koma quenching ve tê qutkirin û nikare florans bike.Dema ku sond hilweşe, maddeya floresentê ji hev vediqete û floransê derdixe.

Lêpirsînek fluorescent li çareseriya reaksiyona PCR tê zêdekirin.Di dema pêvajoya şilkirinê de, sondaya fluorescent dê bi pozîsyona taybetî ya şablonê ve girêbide.Di dema pêvajoya dirêjkirinê de, çalakiya 5'→3' exonukleazê ya enzîma PCR dikare sondaya fluorescentê ya ku bi şablonê re hîbridkirî ye hilweşîne, û maddeya fluorescent ji hev veqetîne ku floransê derxe.Bi tespîtkirina tundiya fluorescence ya sondajê di pergala reaksiyonê de, mebesta şopandina mîqdara zêdekirina hilberê PCR dikare were bidestxistin.

【Hilbijartina Rêbaza Tespîtkirina Fluorescence】

Ger ew ji bo ferqkirina rêzikên bi homolojiya bilind ve were bikar anîn û vedîtina PCR-ya multiplex wekî analîza tîpkirina SNP-ê were kirin, rêbaza sondaya fluorescent nayê veguheztin.
Ji bo ceribandinên din ên Real Time PCR, rêbazek chimera fluorescent a hêsan, hêsan û kêm-mesref dikare were bikar anîn.

probes Taybetmendiyek bihêz, ku dikare PCR-ya multiplex bike

Kêmasî

Pêdiviyên taybetmendiya bilind ji bo amplifikasyonê;

Multilex PCR nikare were kirin Pêdivî ye ku lêkolînên taybetî bêne sêwirandin, lêçûna bilind;

carinan sêwirana sondajê dijwar e

Berhemên Têkildar: