PCR teknolojiya zêdekirina asîda nukleîk a ku herî zêde tê bikar anîn e û ji ber hesasiyet û taybetmendiya xwe bi berfirehî tê bikar anîn.Lêbelê, PCR hewceyê denaturasyona germî ya dubare hewce dike û nikare ji tixûbên pêbaweriya li ser amûr û amûran xilas bibe, ku serîlêdana wê di ceribandina qada klînîkî de sînordar dike.

Ji destpêka salên 1990-an ve, gelek laboratîfan dest bi pêşxistina teknolojiya zêdekirina germahiya domdar a ku hewcedariya denaturasyona termal nake, kirine.Naha wan teknolojiya zêdekirina îzotermî ya bi navbeynkariya loop-ê, teknolojiya zêdekirina îzotermal a veguheztina stûnê, teknolojiya zêdekirina îzotermal a dorhêla gerok, û girêdayîbûna rêza asîda nukleîk pêşve xistine.Teknolojiya zêdekirina îzotermal û teknolojiyên din. 

Lxurtkirina îsotermîk bi navbeynkariya oop

Prensîba zêdekirinê li ser vê rastiyê ye ku DNA li ser 65 ° C di rewşek hevsengiya dînamîkî de ye.Dema ku primera-bingehek bi hev ve bibe û ber bi beşa temamker a ADN-ya du-zindî ve were dirêj kirin, zincîra din dê ji hev veqete û bibe yek-zindî.

Di vê germahiyê de, ADN 4 primerên taybetî bikar tîne da ku xwe bispêre ADN-ya polîmeraza jicîhûwarkirina zincîreyê da ku hevsengiya ADN-ya jicîhûwarkirinê bi domdarî xwe bizivirîne.

Pêşî 6 herêmên taybetî F3, F2, F1, B1, B2, B3 li ser gena armanc diyar bikin, û dûv re li ser bingeha van 6 deverên taybetî 4 primera sêwirînin (wek ku di wêneya jêrîn de tê xuyang kirin):

Destpêka hundurê pêş (FIP) ji F1c û F2 pêk tê.

Destpêka hundurê paşverû (BIP) ji B1c û B2 pêk tê, û TTTT wekî navberek di navîn de tê bikar anîn.

Destpêkên derve yên F3 û B3 bi rêzê ji herêmên F3 û B3 yên li ser gena armanc pêk tên.

Di pergala reaksiyonê ya LAMP de, giraniya primera hundurîn çend caran ji ya primera derve ye.Destpêka hundurîn yekem car bi şablonê re tê berhev kirin da ku stûnek temamker were sentez kirin da ku zincek ducarî ya ADNyê çêbike.Dûv re, primera derve bi şablona şablonê re tê berhev kirin da ku zencîreyek dualî ya DNA çêbike.Di bin çalakiya BstDNA polîmerazê de, zincîra temamker a ku ji hêla primera hundurîn ve hatî sentez kirin derdikeve.Piştî rêzek reaksiyonên, zincîra temamker di dawiyê de bi avahiyek dumbbell zincek DNA ya yekane çêdike.

Struktura dumbbell ADN-ya yekane bi xwe wekî şablonek tê bikar anîn da ku bi domdarî DNA-ya strukturek stem-loopê ya veguhêz bi dawiya vekirî pêk bîne.Destpêkên hundir û derve rênîşandana DNA-ya stûn-loopa veguhêz dikin ku bi domdarî di bertekên jicîhûwarkirin û dirêjkirina stiran de bin, û di dawiyê de gelek strukturên stûn-loop bi dirêjiyên cihêreng ava dikin.tevlihevkirina DNA.

Awantaj û dezawantajên zêdekirina îzotermî ya bi navbeynkariya loop

Avantajên LAMP:

(1) Karbidestiya zêdekirina bilind, ku dikare di nav 1h de 1-10 kopiyên gena armancê bi bandor zêde bike, û karbidestiya zêdekirinê 10-100 carî ji ya PCR ya normal e.

(2) Dema reaksiyonê kurt e, taybetmendî xurt e, û amûrek taybetî ne hewce ye.

Kêmasiyên LAMP:

(1) Pêdiviyên ji bo primers bi taybetî zêde ne.

(2) Hilbera zêdekirî nikare ji bo klonkirin û rêzgirtinê were bikar anîn, lê tenê dikare ji bo dadkirinê were bikar anîn.

(3) Ji ber hesasiyeta wê ya xurt, ew hêsan e ku aerosolan çêbike, dibe sedema erênîyên derewîn û bandorê li encamên testê dike.

Samplification jicîhûwarkirina trand

Zêdekirina veguheztina stûnê (SDA) teknolojiyek zêdekirina DNA-ya isotermal in vitro ye ku li ser bingeha reaksiyona enzîmatîk e ku yekem car ji hêla zanyarê Amerîkî Walker ve di 1992-an de hatî pêşniyar kirin.

Pergala bingehîn a SDA endonukleazek sînordar, DNA polîmerazek bi çalakiya veguheztina stûnê, du cotên primers, dNTP, û îyonên kalsiyûm û magnesium û pergalên tampon vedihewîne.

Prensîba zêdekirina veguheztina stûnê li ser bingeha rêzika nasîna endonukleazê ya sînordarkirî ya bi kîmyewî ve hatî guheztin li her du dawiya DNA-ya armancê ye.Endonukleaz valahiya ADN-a zincîra li cihê xwe yê naskirinê vedike, û ADN-polîmeraz valahiya 3' Dawî dirêj dike û li şûna bendika ADNyê ya din digire.

Rêzên yekbûyî yên ADNyê yên ku hatine veguheztin dikarin bi primeraran re werin berhev kirin û ji hêla DNA polîmerazê ve di nav zincîrên ducarî de werin dirêj kirin.Ev pêvajo bi domdarî tê dubare kirin, da ku rêzika armanc bi bandor were zêdekirin.

Awantaj û dezawantajên teknolojiya zêdekirina jicîhûwarkirina stûnê

Avantajên SDA:

Karbidestiya amplifikasyonê bilind e, dema reaksiyonê kurt e, taybetmendî xurt e, û amûrek taybetî hewce nake.

Kêmasiyên SDA:

Hilber ne yekreng in, û hin hilberên yek-zindî û du-zindî her gav di çerxa SDA-yê de têne hilberandin, û dema ku bi elektroforezê ve were tesbît kirin dê dûvik bê guman çêbibe.

Rzêdekirina çembera olling

Zêdekirina çembera gerok (RCA) bi xêzkirina li ser rêbaza kopîkirina ADN-ê ji organîzmayên pathogenîk bi çerxa gêrkirinê tê pêşniyar kirin.Ew bi karanîna ADN-ya dorhêl a yek-zindî wekî şablonek li germahiyek domdar, û ADN-yek polîmerazek taybetî (wek Phi29) ) di bin çalakiya senteza DNA ya dorhêlê de ji bo bidestxistina zêdekirina gena armancê vedibêje.

RCA dikare di nav amplification linear û amplification exponential de were dabeş kirin.Karbidestiya RCA ya linear dikare bigihîje 10⁵car caran, û karbidestiya RCA ya berbiçav dikare bigihîje 10⁹caran.

Cûdahiya sade, wekî ku di jimareya jêrîn de tê xuyang kirin, zêdekirina xêzik a tenê 1 pêşbirkê bikar tîne, zêdekirina berbelav b 2 primerê hene.

Ji RCA-ya xêzkirî re jî tê gotin RCA-a yekem a yekem.Destpêkek bi ADN-ya dorhêl ve girêdide û bi çalakiya DNA polîmerazê tê dirêj kirin.Berhem xêzek yekane ye ku bi hejmareke mezin rêzikên dubarekirî bi hezaran carî dirêjahiya yek hêlekê ye.

Ji ber ku hilbera RCA ya xêzkirî her gav bi primera destpêkê ve girêdayî ye, rastkirina hêsan a sînyalê avantajek sereke ye.

RCA-ya berbiçav, ku wekî HRCA-hêzkirina Hîper şaxkirî jî tê zanîn, di RCA-ya berfereh de, arîmerek hilbera RCA zêde dike, arîmera duyemîn bi hilbera RCA re hîbrîdîze dibe û dirêj dibe, û veguheztin jixwe bi hilbera RCA ve girêdayî ye.

Awantaj û dezawantajên zêdekirina asîda nukleîk a dorhêlê

Avantajên RCA:

Hestiyariya bilind, taybetmendiya baş û operasyona hêsan.

Kêmasiyên RCA:

Pirsgirêkên paşîn di dema tespîtkirina sînyalê de.Di dema reaksiyona RCA-yê de, sondaya kilîtkirî ya necirkuler û DNA an RNA-ya şablonê ya sondaya negirêdayî dibe ku hin îşaretên paşîn biafirînin. 

NAmplification-based sequence ucleicacid

Amplification-based sequence acid (NASBA) teknolojiyek nû ye ku li ser bingeha PCR hatî pêşve xistin.Ew zêdekirina asîda nukleîk a domdar û îzotermîk e ku ji hêla cotek primerên bi rêzek pêşverû ya T7 ve tê rêve kirin.Teknolojî dikare di nav 2 demjimêran de RNA-ya şablonê bi qasî 109 carî zêde bike, ku ev yek 1000 carî ji rêbaza PCR ya kevneşopî bilindtir e û pêdivî bi alavên taybetî nake.

Ev teknolojî ji bo teşhîskirina bilez a nexweşiyan gava ku xuya bû hatî bikar anîn, û gelek pargîdan niha vê rêbazê di kîtên tespîtkirina RNA de bikar tînin.

Her çend zêdekirina RNA jî dikare teknolojiya PCR-ya veguheztina berevajî bikar bîne, NASBA avantajên xwe hene: ew dikare di bin şert û mercên germahiya domdar de were meşandin, û ew ji teknolojiya kevneşopî ya PCR-ê domdar û rasttir e.

Reaksîyon di 41 dereceya Celsius de ye û ji bo temamkirina AMV (vîrûsa myeloblastoza hewavan) transkrîptaza berevajî, RNase H, T7 RNA polîmeraz û cotek primera pêdivî ye.

Pêvajo bi gelemperî pêk tê:

Destpêka pêşîn rêzika temamker a promotorê T7 dihewîne.Di dema reaksiyonê de, primera pêşeroj bi zincîra ARNyê ve girêdide û ji hêla enzîma AMV ve tê katalîz kirin da ku zincîra ducarî ya DNA-RNA çêbike.

RNase H ARN-a di zincîra dubendî ya hîbrîd de dihele û ADNya yek-zindî diparêze.

Di bin çalakiya primerê berevajî û enzîma AMV de, zencîreyek dualî ya ADN-ê ya ku rêzika pêşekkera T7 vedihewîne, çê dibe.

Di bin çalakiya T7 RNA polymerase de, pêvajoya transkripsiyonê qediya û hejmareke mezin a RNA-ya armanc tê hilberandin.

Avantajên NASBA:

(1) Destpêka wê rêzek promotorek T7 heye, lê ADN-ya biyanî ya dubendî rêzika pêşverû ya T7 tune û nayê zêdekirin, ji ber vê yekê ev teknolojî xwedan taybetmendî û hesasiyeta bilind e.

(2) NASBA rasterast pêvajoya veguheztina berevajî di nav reaksiyona zêdekirinê de vedihewîne, dema reaksiyonê kurt dike.

Dezawantajên NASBA:

(1) Parçeyên reaksiyonê tevlihevtir in.

(2) Sê celeb enzîman hewce ne ku lêçûna reaksiyonê bilindtir bikin.