RT-qPCR ceribandina bingehîn a biyolojiya molekulî ye, û divê her kes pê nas bike.Ew bi gelemperî sê gavan vedihewîne: derxistina RNA, veguheztina berevajî li cDNA, û PCR-ya mîqdar a fluorescent ya rast-ê.Ew alîkarî nake, çi diqewime?Îhtîmal e ku pirsgirêkek heyeazmûna veguherîna berevajî!Her çend dixuye ku ceribandina veguheztina berevajî tenê hewce dike ku RNA, dNTP, destpêk ûtranskriptase berevajîbi lûleya santrîfujê re bikevin û baş tevlihev bikin, lê di pêvajoya xebata rastîn de, hîn jî gelek hûrgulî hene ku hewce ne ku bala xwe bidin wan.Ka em li ser wê fêr bibin!

Meriv çawa qalîteya RNA-yê dadbar dike?
Ji bo bidestxistina cDNA, kalîteya RNA krîtîk e!Qalîteya RNA bi giranî ji du aliyan ve tê destnîşankirin:
(1) Yekbûna RNA:Yekbûna RNA dikare bi elektroforeziya gel agarose ve were verast kirin. Eukaryots wek nimûne bigirin, ARN-ya tevahî ya tevahî sê bendên zelal hene, giraniya molekulê ji mezin û piçûk 28S, 18S, û 5S ne, û 28S du caran ji 18S-ê ronîtir e;ger sê bend bên dîtin, lê tîpa bandê şêlû be an jî Belavbûn tê wê wateyê ku ARN bi qismî hilweşiyaye.Di vê demê de, ji kerema xwe reaksiyona veguheztina berevajî tavilê pêk bînin û têketina şablonê bi rêkûpêk zêde bikin;heke tenê bendek bi giraniya molekularî ya piçûk an bê bend were dîtin, ARN bi tevahî hilweşiyaye û pêdivî ye ku ji nû ve were derxistin.Agilent 2100 bi diyagrama lûtkeyê û nirxa RIN re yekbûna RNA destnîşan dike.Ger asîda nukleîk saxlem be, xêza bingehîn ya elektroferogramê safî ye;heke asîda nukleîk bi giranî were hilweşandin, xêza bingehîn nehevseng e û bêtir lûtkeyên hilweşandinê xuya dibin;nirxa RIN yekitiya ARNyê nîşan dide, di nav rêza 0-10 de, nirx çiqas mezintir be, qalîteya RNA çêtir dibe.Welê, asta temambûnê çiqas bilindtir e.
(2) Paqijiya RNA:Rêjeya OD260/280 dikare bi spektrofotometrîya UV were tespît kirin.Ger rêjeya OD260/280 di navbera 1.9 û 2.1 de ye, paqijî pir baş e.
ADNya genomîk a bermayî dikare bibe sedema encamên nerast ên hejmarî
Dema ku ARN tê derxistin, ARNya ku em distînin dibe ku bi ADNya genomîk (gDNA) ya ku nehatiye paqijkirin re were tevlihev kirin.Ji ber vê yekê, cDNA piştî veguheztina berevajî dê bi hev re jî were tevlihev kiringDNA.Di dema xwarê deqPCRbersivî,cDNAû gDNA dibe ku bi hevdemî were zêdekirin, di encamê de nirxek CT-ya piçûktir çêbibe, ji ber vê yekê dibe ku encam beralî bin.
Ji ber vê yekê divê em di vê rewşê de çi bikin?Foregenepêşniyar dike:
(1) Paqijkirina genomê li ser RNA-ya berevajîkirî, ya ku di dema derxistina RNA de bi derxistina stûnê ve were rakirin, bikin;
(2) ARN-ya hatî derxistin bi DNase re derman bikinI , lê bi EDTA biqedîne;
ji reagentên veguherîna berevajîbi modulên paqijkirina genomê;

Meriv çawa primerên ji bo veguheztina berevajî hilbijêrin?
Destpêkên veguheztina berevajî jî bandorê li encamên reaksiyona veguheztina berevajî dike.Hûn dikarin li gorî şert û mercên taybetî yên azmûnê ji bo veguheztina berevajî primerên random, Oligo dT an primerên gen-taybet hilbijêrin:
(1) Nivîsarên taybetî: primerên taybet ên genê têne pêşniyar kirin;
(2) Nivîsarên perçeyên dirêj: Oligo dT/primerên taybet ên genê têne pêşniyar kirin;
(3) Parçeyên hundurîn ên transkrîptên beşê dirêj: primerên gene-taybetî/ primerên rasthatî / primerên rasthatî + Oligo dT.Ger ceribandina paşîn a qPCR were kirin, Oligo dT nikare bi tenê were bikar anîn, ji ber ku karanîna Oligo dT tenê dikare bibe sedema 3' beralîkirina dawiya , ku bibe sedema encamên ceribandina qPCR nerast;
(4) miRNA: Dikarin primerên stem-loop an primerên dûvik werin bikar anîn.

Divê cDNA-ya hilbera veguheztina berevajî çend caran ji bo pîvandinê were rijandin?
Piştî bidestxistina cDNA ya hilbera veguheztina berevajî, çend caran cDNA divê ji bo ceribandinên qPCR were rijandin pir girîng e.Ger giraniya cDNA pir zêde an jî pir kêm be, dibe ku bandorkirina amplification bandor bike.Meriv dikare hûrbûna cDNA were pîvandin, û divê ew çawa were kirin?
(1) Giraniya cDNA ya hilbera veguheztina berevajî nikare were pîvandin, ji ber ku ji bilî hilbera cDNA, hilbera veguheztina berevajî di heman demê de tamponek bermayî ya veguheztina berevajî, transkrîptaza berevajî, destpêk, û hwd. jî vedihewîne, ku dê di encamên pîvandina berhevokê de mudaxele bike û bibe sedema OD260/280, OD260/280, OD200D ne rast û OD200D nagire.Di vê demê de hinek heval wê bibêjin, ezê piştî safîkirinê bipîvin;Li vir, Foregene dixwaze bi bîr bîne ku cDNA nayê pêşniyar kirin ku were paqij kirin, ji ber ku dirêjahiya cDNA ya ku ji hêla vegerandinê ve hatî wergirtin cûda ye, û cDNA-ya kurt dê di paqijkirinê de winda bibe.
(2) Ji ber vê yekê çi bikin?Beriya ceribandina qPCR, gradienta dilopkirina cDNA dikare bi ceribandina pêşîn were destnîşankirin.Mînakî: çareseriya stokê ya cDNA, helandina 10 qat, û 100 qat rijandina wekî şablon ji bo ceribandinên qPCR bikar bînin, û faktora dirûnê ya bi nirxa CT-ê di navbera 18-28 de hilbijêrin.

Divê miRNA çawa berevajî werin veguheztin?
miRNA RNA molekulek piçûk a yek-zindî ye ku mezinahiya wê bi qasî 22 nt ye ku ji bo proteîn kod nake.Ji ber dirêjahiya wê ya kurt, rêbaza qPCR ya kevneşopî dijwar e ku rasterast were hejmartin, ji ber vê yekê pir caran hewce ye ku miRNA were dirêj kirin;rêbazên veguheztina berevajî yên ku bi gelemperî ji bo miRNA têne bikar anîn, rêbaza stem-loop û rêbaza dûvikê vedihewîne.
Rêbaza stem-loop dirêjkirina miRNAyê bi lêzêdekirina primerên stem-loop e.Ev rêbaza tespîtkirinê hestiyar û taybetmendiyek bilindtir e, lê berbi tespîtê kêm e.Yek transkrîpsyonek berevajî tenê dikare yek miRNA û referansek navxweyî tespît bike;rêbaza lêzêdekirina dûvikê ji duyan pêk tê Ew bi çalakiya hevbeş a du enzîman, ku PolyA polîmeraz û transkrîptaza berevajî ne, temam dibe.PolyA polymerase berpirsiyar e ku dûvikên PolyA li miRNA zêde bike da ku dirêjahiya wê zêde bike, û transkrîptaza berevajî reaksiyona veguheztina berevajî dike.Ev rêgez xwedan rêgeza vedîtina bilind e û dikare gelek miRNA û referansên navxweyî di yek veguheztina berevajî de tespît bike, lê hesasiyet û taybetmendî di rêbaza stem-loop de kêm e.