PCR, pircar PCR, Di cih de PCR, Reverse PCR, RT-PCR, qPCR (1)–PCR

Em ê têgîn, gav û hûrguliyên cûrbecûr PCR-ê ji hev veqetînin

Ⅰ. PCR

Reaksiyona Zincîra Polymerase, ku wekî PCR tê binav kirin, teknolojiyek biyolojîkî ya molekulî ye ku ji bo mezinkirina perçeyên DNA yên taybetî tê bikar anîn.Ew dikare wekî nûvekirinek taybetî ya DNA di vitro de were hesibandin.ADN polymerase (DNA Polymerase I) di destpêka sala 1955-an de hat keşfkirin, û Klenow Fragment of E. Coli, ku xwediyê nirx û pratîkbûna ceribandinê ye, di destpêka salên 1970-an de ji hêla Dr.Enzîmên ku îro tên bikaranîn (bi navê Taq polymerase), di sala 1976-an de ji Thermus aquaticus, bakteriya kaniya germ, hatin veqetandin. Taybetmendiya wê ew e ku dikare li hember germahiya bilind li ber xwe bide û enzîmek îdeal e, lê piştî salên 1980-an pir tê bikar anîn.Konsepta orîjînal a prototîpa primitive ya orîjînal a PCR dişibe tamîrkirin û kopîkirina genê, ku ji hêla Dr.PCR-ya ku îro hatî pêşve xistin ji hêla Dr. Kary B. Mullis ve di sala 1983-an de hate pêşve xistin. Dr.Dr. Mullis di sala 1985-an de yekem kaxeza têkildar bi Saiki û yên din re bi fermî çap kir. Ji hingê ve, karanîna PCR rojane bi hezaran kîlometre ye, û meriv dikare bibêje ku qalîteya kaxezên têkildar gelek rêbazên lêkolînê yên din ne xweş dike.Dûv re, teknolojiya PCR bi berfirehî di lêkolîna zanistî ya biyolojîkî û serîlêdanên klînîkî de tê bikar anîn, û dibe teknolojiya herî girîng a lêkolîna biyolojiya molekulî.Mullis di sala 1993 de jî Xelata Nobelê ya Kîmyayê wergirt.

PCRRêzman

Prensîba bingehîn a teknolojiya PCR-ê dişibihe pêvajoya nûvekirina xwezayî ya DNA-yê, û taybetmendiya wê bi primera oligonukleotidê ve girêdayî ye ku ji her du dawiya rêza armancê re temam dike.PCR ji sê gavên reaksiyonên bingehîn ên dejenerasyon-pêjandin-dirêjkirinê pêk tê: ①Dejenerasyona ADN-ya şablonê: Piştî ku DNA-ya şablonê ji bo demek diyarkirî heya 93°C tê germ kirin, çareseriya DNA ya dualî ya ji bo DNA-zincîra dualî ya ku ji hêla PCR-ya zêdekirina şablonê ve hatî çêkirin çêdibe, ew dikare wekî reaksiyonên din ji bo zincîra din were berhev kirin.②Pêjikandina (tevlihev) ADNya şablonê û primerê: Piştî ku ADNya şablonê tê germkirin û di zincîreke yekane de dejenere dibe, germahî dadikeve nêzî 55°C.Rêzeya temamker a yekem-zincîra DNA ya şablonê.③ Berfirehkirina primerê: Şablonek DNA-girêdana primer li ser bingeha çalakiya TaqDNA polîmerazê ye, ku dNTP wekî madeya xav a reaksiyonê ye.Prensîba dubarekirinê bihêlin, zincîreyek kopyaya nîv-parastî ya nû ya ku zincîra ADN-ya şablonê temam dike sentez bikin, û dûbarekirina çerxa dejenerasyon-pêkirin-berfirehkirina sê pêvajoyan dikarin bêtir "zincîra kopî ya nîv-parastî" bistînin, û ev zincîra nû dîsa peyda dibe Ji bo çerxa din bibe şablon.Ew 2-4 hûrdeman digire da ku lûkê temam bike, genê armanc dikare di 2-3 demjimêran de çend mîlyon carî were zêdekirin.

RêzanPCRPergala Reaksiyonê

Pênc hêmanên reaksiyona PCR

Di reaksiyona PCR-ê de bi gelemperî pênc celeb maddeyên têkildar hene, ango primer, enzîm, dNTP, şablon û tampon (Mg2+ hewce ye).[Pêvajoya PCR]

Pêvajoya PCR ya standard di sê gavan de tê dabeş kirin

1. Dejenerasyona ADNyê (90°C-96°C): Şablonên ADNyê-zincîra dualî di bin çalakiya termalê de, girêkên hîdrojenê diqetin, ADNya yek-zincîreyê çêdikin.

2. Lêkirin (25℃ -65℃): Germahiya pergalê kêm dibe, primerê bi şablona DNA re tê hev kirin da ku zincîrek dualî ya herêmî ava bike.

3. Berfirehkirin (70℃ -75℃): Di bin çalakiya Taq enzîma (nêzîkî 72°C, çalakiya herî baş), dNTP wekî madeya xav tê bikar anîn, ji dawiya 5' ya destpêkê → dawiya 3' dirêj dibe, sentez û şablon zincîra DNA ya din temam dikin.

Her çerxek tê denaturîzekirin, helandin û dirêjkirin, naveroka DNAyê duqat dibe.Heya nuha, ji ber qada zêdekirina kurt, hin PCR dikare di demek pir kin de were dubare kirin jî heke çalakiya enzîma Taq ne çêtirîn be jî, ji ber vê yekê ew dikare bi du gavan were guheztin, ango helandin û dirêjkirin dikare di heman demê de li 60 °C-65 °C were kirin.Ji bo ku pêvajoya hilgirtin û sarbûnê kêm bikin û leza bersivê baştir bikin.

Taybetmendiyên Reaksiyona PCR

● Taybetmendiya Bilind

Faktorên diyarker ên taybetî yên bersiva PCR ev in: ① Tevhevbûna taybetî ya primer û DNA-ya şablonê.② Prensîba berhevkirina bingehîn.③Parastina reaksiyona senteza polîmerase ya TaqDNA.④ Taybetmendî û muhafezekarbûna genê armanc.

Kombûna rast a primers û şablonan mifteyê ye.Girêdana primerê û şablonê û dirêjkirina zincîra aşîtê li ser prensîba lihevkirina bingeha alkalînê ye.Pabendbûna reaksiyonên senteza polîmerazê û berxwedana germahiya bilind a Taq DNA-ya polîmeraza ji bo çêkirina girêdana (tevlihev) şablon û primerê di reaksiyonê de dikare li germahiyek bilindtir were kirin.Taybetmendiya tevliheviyê pir zêde dibe.Klîp dikare asteke bilind a rastbûnê biparêze.Bi bijartina herêmek genetîkî ya armanc bi muhafezekarbûn û muhafezekarîya bilind, taybetmendiya wê bilindtir e.

● Hesasiya Bilind

Hêjeya hilberîna hilberên PCR-ê bi îndeksê zêde dibe, ku dikare şablona destpêkê ya Picker (PG=10-12) berfireh bike da ku asta mîkrokontrolerê bigihîje asta mîkrograman (μg= -6).Hucreyek armanc dikare ji 1 mîlyon hucreyan were tesbît kirin;di tespîtkirina vîrusan de, hesasiyeta PCR dikare bigihîje 3 RFU (yekîneyên ku xalên vala têne çêkirin);di zanistiya bakteriyan de rêjeya herî kêm 3 bakterî ye.

● Hêsan û Bilez

Refleksiyona PCR-ê polîmerazek Taq DNA-ya bi germahiya bilind bikar tîne, ku çareseriya reaksiyonê di yek carê de zêde dike, ango reaksiyonek dejenerasyon-anneal-berfirehkirinê li ser çareseriya zêdekirina DNA-yê û potek serşokê ya avê.Bi gelemperî, reaksiyona amplification di 2-4 demjimêran de qediya.Berhemên zêdekirî bi gelemperî ji hêla şûrê elektrîkê ve têne analîz kirin, û ne hewce ne ku îzotopan bikar bînin, ne qirêjiya radyoaktîf, û pêşveçûna hêsan.

● Paqijiya nimûneyê kêm e

Ne hewce ye ku vîrus an bakterî û şaneyên çandê ji hev veqetînin.Berhemên xav ên ADN û RNA dikarin wekî amplifikator werin bikar anîn.Tespîtkirina zêdekirina DNA dikare rasterast bi karanîna nimûneyên klînîkî yên wekî xwîn, şilava laş, şilava şuştina kuxikê, por, hucre, û tevna zindî were bikar anîn.

PCRpirsgirêkên hevpar

● Negatîfên derewîn, bandên zêdekirî tune

Qonaxên sereke yên reaksiyona PCR ev in: ① amadekirina asîdên nukleî yên şablonê, ② kalîte û taybetmendiya destpêk, ③ kalîteya enzîman ④ şert û mercên çerxa PCR.Dîtina sedem jî divê ji bo girêdanên jorîn were analîz kirin û lêkolîn kirin.

Şablon: ① Di şablonê de proteînek cihêreng heye, ② Di şablonê de înhîbîtorek enzîma Taq heye, ③ Proteîna di şablonê de nayê rakirin, nemaze proteîna komê ya di kromozomê de.⑤ Dejenerasyona asîda nukleîk a deminer ne bi tevahî ye.Gava ku kalîteya enzîm û primeran baş be, bendek amplîfasyonê tune, ku bi îhtîmalek mezin dermankirina digestive ya nimûneyan e.Di pêvajoya derxistina asîda nukleîk a şablonê de tiştek xelet heye, ji ber vê yekê ji bo amadekirina çareseriyek helandinê ya bi bandor û bi îstîqrar, divê prosedûra wê were sererast kirin û ne bi kêfî were guheztin.

Bêçalakkirina enzîmê: Enzîmek nû an jî enzîmên kevin û nû divê bi hev re werin bikar anîn da ku analîz bikin ka çalakiya enzîmê winda ye an ne bes e, ev dibe sedema neyînîyên derewîn.Pêdivî ye ku were zanîn ku enzîma Taq an bromîdê etidium carinan carinan têne ji bîr kirin.

Destpêk: qalîteya aşîtê, tewandina aşîtê, û gelo tewra her du primerê sîmetrîk e.Ew sedemek hevpar e ku têkçûna PCR an jî band zêde ne îdeal e û meyldar e ku belav bibe.Pirsgirêkên bi kalîteya primerên hin hejmarên hevîrê hene.Her du primera xwedan konsantreyek bilind û konsantreyek nizm in, ku dibe sedema xurtkirina asîmetrîk ya kêm-bandor.Tedbîrên berevajî ev in: ① Ji bo sentezkirina yekîneyan destpêkek baş hilbijêrin.② Giraniya primerê ne tenê bi nirxa OD ve girêdayî ye, lê di heman demê de balê dikişîne ser şilava orîjînal a primerê jî da ku elektroforezkirina gela şekir agar çêbike.Pêdivî ye ku deverek rêzika aşîtê hebe, û ronahiya her du primerê divê bi gelemperî hevgirtî be.Dibe ku kember, PCR di vê demê de têk biçe, û divê ew bi yekîneya senteza primer re were çareser kirin.Ger primerek bilind be, ronî kêm e, û dema ku tê rijandin divê konseya wê hevseng be.③ Pêdivî ye ku arîkar bi dravdanek zêde were hilanîn û hilanîn da ku pêşî li gelek cemidandin an sarbûna demdirêj a beşên sarincokê bigire, ku dê bibe sedema xerabûna û xerabûna primerê.④ Sêwirana primerê ne maqûl e, wek ku dirêjahiya aşîtê têrê nake, û di navbera primerê de komik çêdibe.

Mg2 + konsantasyon: Kêmbûna Mg2 + ion bandorek mezin li ser karîgeriya zêdekirina PCR dike.Kêmbûna zêde dikare zayenda berevajî ya zêdekirina PCR kêm bike.Ger konsantasyon pir kêm be, dê derketina zêdekirina PCR-ê jî bêyî band berfirehbûnê têk bibe.

Guhertina qebareya reaksiyonê: Hêjeya ku di zêdekirina PCR de tê bikar anîn 20ul, 30ul, û 50ul an 100uL e, qebareya mezin a serîlêdana ji bo zêdekirina PCR li gorî mebestên cihêreng ên lêkolîna zanistî û ceribandina klînîkî tê danîn.Piştî çêkirina cildên piçûk ên wekî 20ul, pêdivî ye ku dema çêkirina pîvanê şertek kordê çêbike, wekî din ew ê têk nebe.

Sedemên laşî: Veguherîn ji bo zêdekirina PCR pir girîng e.Ger germahiya dejenerasyonê kêm be, dema dejenerasyonê kurt be, dibe ku di neyînîyên derewîn de çêbibe;Germahiya pir nizm a lêdanê dikare bibe sedema zêdekirina ne-taybetî û kargêriya zêdekirina taybetî kêm bike.Ji bo kêmkirina kargêriya zêdekirina PCR-ê pir bandor li hevberdana primer û şablonan dike.Carinan hewce ye ku termometreyên standard bikar bînin da ku guhêrbarî, lêdanbûn û germahiya dirêjkirî ya di dirêjkirinê de an kulika ku di avê de tê çareser kirin de were tesbît kirin, ku yek ji sedemên têkçûna PCR-ê ye.

Guhertoyên rêza armancê: Heke rêzika armanc çêbibe, mutasyonek an jêbirin, têkelbûna prototîp û şablonê bi hev re be, an ji ber nebûna rêzek armancê, dê primer û şablon rêza temamker winda bikin, û zêdekirina wê ya PCR dê bi ser nekeve.

● Derew erênî

Banda zêdekirina PCR bi band rêza armancê re hevaheng xuya dike, û carinan bandê wê xweştir û bilindtir e.

Sêwirana primer ne guncaw e: rêzika zêdekirina hilbijartî û rêzika zêdekirina ne-armanc homolog in, ji ber vê yekê dema ku zêdekirina PCR-ê, hilberên PCR-ya zêdekirî rêzikên ne-armanc in.Rêzeya armancê pir kurt e an jî arîkar pir kurt e, û ew mêldarê erênîbûna derewîn e.Pêdivî ye ku ji nû ve were sêwirandin.

Xaça qirêjiya rêza armanc an hilberên zêdekirinê: Du sedemên vê qirêjiyê hene: Yekem, xaçeperezbûna tevahiya genom an beşên mezin, ku dibe sedema erênîyên derewîn.Ev celeb pozîtîfiya derewîn bi awayên jêrîn dikare were çareser kirin: Di dema xebatê de baldar û nerm bin da ku rê nedin rêzika armancê di nav çeka nimûneyê de nefes bibe an ji lûleya centrifûgal dernekeve.Ji xeynî enzîm û maddeyên ku nikaribin li ber germahiya bilind bisekinin, divê hemî reagent an amûr bi tansiyona bilind bêne dezenfekte kirin.Pêdivî ye ku lûleyên centrifûgal û nimûne di yek carî de bêne bikar anîn.Dema ku hewce be, berî ku nimûneyan lê zêde bike, lûleya reaksiyonê û reagent li ber tîrêjên ultraviolet têne rûxandin da ku acîdeya nukleî ya heyî hilweşîne.Ya duyemîn, perçeyên piçûk di qirêjiya hewayê de.Van perçeyên piçûk ji rêzika armancê kurttir in, lê hin homologiya wan heye.Ew dikare bi hevûdu re were veqetandin.Piştî temamkirina primers, hilbera PCR dikare were berfireh kirin, ku dê bibe sedema hilberîna erênî ya derewîn.Ew dikare ji bo kêmkirin an ji holê rakirina rêbaza hêlînê PCR were bikar anîn.

● Bandora zêdekirina netaybetî xuya bike

Bendên ku piştî zêdekirina PCR-ê derketine li gorî mezinahiya hêvîkirî, an mezin an piçûk, an di heman demê de, an di heman demê de, bandên zêdekirina taybetî û bandên zêdekirina ne-taybetî ne.Derketina bandên ne-taybet ev e: Yekem, primer bi rêzika armancê re ne temam in, an jî polîmerîzekirina primerê ji bo avakirina komekê.Ya duyemîn ev e ku giraniya îyonên MG2+ pir zêde ye, germahiya annealkirinê pir kêm e, û hejmara çerxên PCR bi hev ve girêdayî ye.Ya duyemîn, kalîte û mîqdara enzîman.Pir caran, enzîmên hin çavkaniyan ji bendên ne-taybetî re têkildar in û enzîmên çavkaniyek din çênabin.Carinan zêdekirina netaybetî ya enzîman jî çêdibe.Tedbîrên berevajî ev in: Ger hewce be balkêş ji nû ve hatine sêwirandin.Hejmara enzîmê kêm bike an enzîma çavkaniyek din biguhezîne.Mîqdara seretayî kêm bikin, mîqdara şablonan bi rêkûpêk zêde bikin, û hejmara dewreyan kêm bikin.Bi rêkûpêk germahiya lêdanê zêde bikin an jî rêbaza du xalên germahiyê bikar bînin (dejenerasyona 93 °C, helandin û li dora 65 °C dirêj kirin).

● Tîrêj an kasêta şilandinê xuya bike

Hêzkirina PCR carinan xuya dike ku tê sepandin an şêlandin an kembera mîna xalîçeyê.Ji ber vê sedemê, ji ber pirbûna zêde ya enzîman an jî ji ber kalîteya nebaş a enzîmê, giraniya dNTP pir zêde ye, giraniya Mg2+ pir zêde ye, germahiya lêdanê pir kêm e, û hejmara dewreyan pir zêde ye.Tedbîrên dijber ev in: ①Mejmara enzîman kêm bikin, an jî enzîma çavkaniyek din biguherînin.②Kêmbûna dNTP kêm bikin ③ Bi rêkûpêk hûrbûna Mg2+ kêm bikin.④Hejmara şablonan zêde bikin û hejmara dewreyan kêm bikin.

Berhemên Têkildar

PCR Heroᵀᴹ (Bi Dye)

◮ Baweriya bilind: 6 qat ji ya enzîma Taq a asayî;

◮ Leza zêdekirina zûtir

◮ Zêdetir adaptasyona şablonê

◮ Karbidestiya zêdekirina zêde

◮ Toleransa jîngehê bihêztir e: hefteyekê li 37°C tê danîn, ji %90 zêdetir çalakiyê diparêze;

◮ Ew 5'→3' çalakiya DNA polymerase û 5'→3' çalakiya exonuclease heye, bêyî çalakiya 3'→5' exonuclease.

PCR Easyᵀᴹ (Bi Dye)

Pergala reaksiyonê ya bêhempa û Taq DNA Polymerase-a-berbiçav dike ku reaksiyona PCR xwedan bertek, taybetmendî û hesasiyetek bilindtir e.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Yek Gav)-SYBR Kesk I

◮ Kîta yek-gavekî veguhertina berevajî û qPCR du reaksiyonên di heman boriyê de çêdike, tenê hewce ye ku RNA-ya şablonê, primerên PCR-ya taybetî û ddH-ya Bê-RNase lê zêde bike.₂O.

◮ Kit dikare bi lez û bez bi qasê RNA-ya vîrus an RNA-ya şopandinê analîz bike.

◮ Kit reagentek veguheztina berevajî ya Foregene û Foregene HotStar Taq DNA Polymerase bi pergalek reaksiyonê ya bêhempa ve tê bikar anîn da ku bi bandor karûbarê zêdekirin û taybetmendiya reaksiyonê baştir bike.

◮ Pergala reaksiyonê ya xweşbîn dike ku reaksiyonê xwedan hestiyariya vedîtina bilind, aramiya germî ya bihêztir û toleransek çêtir e.

◮ RT-qPCR Hêsan^TM(Yek Gav) - Kîta SYBR Green I bi rengê referansa navxweyî ya ROX re tê, ku dikare were bikar anîn da ku paşnavê nîşanê û xeletiyên nîşana di navbera bîran de ji holê rake, ku ji xerîdaran re hêsan e ku di modelên cihêreng ên amûrên PCR-ya jimareyî de bikar bînin.

RT Easy^TMII (Master Premix ji bo senteza cDNA-ya yekem ji boWextê rast PCR)

-Qanûna bikêrhatî ya rakirina gDNA, ku dikare di nav 2 hûrdeman de gDNA di şablonê de jê bibe.

-Pergala veguheztina berevajî ya bi bandor, ew tenê 15 hûrdeman digire da ku senteza cDNA-ya stûna yekem temam bike.

-Şablonên tevlihev: şablonên bi naveroka GC-ya bilind û strukturên navîn ên tevlihev jî dikarin bi karbidestiya bilind berevajî bibin.

-Pergala veguheztina berevajî ya bi hesasiya bilind, şablonên asta pg jî dikarin cDNA-ya kalîteya bilind bistînin.

-Pergala veguheztina berevajî xwedan îstîqrara germî ya bilind e, germahiya reaksiyonê ya çêtirîn 42℃ e, û hîn jî di 50℃ de performansa veguheztina berevajî ya baş heye.