PCR (reaksiyona zincîra polymerase) yek ji teknolojiyên zêdekirina DNA-ya in-vitro ye, ku ji 30 salan zêdetir dîrokek wê heye.

Teknolojiya PCR ji hêla Kary Mullis ya Cetus, USA di 1983 de pêşeng bû. Mullis di sala 1985-an de serlêdana patenta PCR kir û di heman salê de yekem kaxeza akademîk a PCR li ser Zanistê weşand.Mullis di sala 1993 de ji ber xebatên xwe Xelata Nobelê ya kîmyayê wergirt.

Prensîbên bingehîn ên PCR

PCR dikare perçeyên DNA yên armanc ji mîlyonek carî zêde bike.Prensîb di bin katalîzasyona ADN-ya polymerase de ye, bi karanîna ADN-ya dêûbav wekî şablon û pêşînek taybetî wekî xala destpêkê ya dirêjkirinê tê bikar anîn.Ew di vitro de bi gavên wekî denaturasyon, helandin, û dirêjkirinê tê dubare kirin.Pêvajoya ADN-ê ya keçikê ya ku bi ADN-ya şablonê stûna dêûbav re temam dike.

Pêvajoya PCR ya standard di sê gavan de dabeş dibe:

1.Denaturasyon: Germahiya bilind bikar bînin da ku xêzên ADNyê yên ducar ji hev veqetînin.Girêdana hîdrojenê ya di navbera rêzikên ducarî yên ADNyê de di germahiya bilind de (93-98℃) tê şikandin.

2.Annealing: Piştî ku ADN-ya dubendî ji hev tê veqetandin, germahiyê dadixin da ku prîmer bi ADNya yek-zindî ve girêbide.

3. Berfirehkirin: ADN polymerase dema ku germahî tê daxistin dest bi sentezkirina ristên temamker ên li ser bendikên ADNyê ji primerên girêdayî dike.Dema ku dirêjkirin qediya, çerxek qediya, û hejmara perçeyên DNA du qat dibe

Ger van her sê gavan 25-35 caran bizivirînin, dê hejmara perçeyên DNAyê qat bi qat zêde bibe.

Zehmetiya PCR ev e ku primerên cihêreng dikarin ji bo genên mebestên cihêreng werin sêwirandin, da ku perçeyên genê hedef di demek kurt de werin zêdekirin.

Heya nuha, PCR dikare li sê kategoriyan were dabeş kirin, ango PCR-ya asayî, PCR-ya mîqdar a fluorescent û PCR-ya dîjîtal.

Nifşa yekem a PCR ya asayî

Amûrek zêdekirina PCR ya asayî bikar bînin da ku genê armanc zêde bikin, û dûv re elektroforeziya gel agarose bikar bînin da ku hilberê nas bikin, tenê analîzek kalîte dikare were kirin.

Dezawantajên sereke yên nifşa yekem PCR:

1.Meyla zêdekirina ne-taybet û encamên erênî yên derewîn.

2.Tespîtkirin demeke dirêj digire û emeliyat giran e.

3.Tenê testa kalîteyê dikare were kirin

PCR-Nifşa duyemîn Real-Time

Real-Time PCR, ku wekî qPCR jî tê zanîn, sondajên fluorescentê bikar tîne ku dikarin pêşkeftina pergala reaksiyonê destnîşan bikin, û berhevkirina hilberên zêdekirî bi berhevkirina nîşanên fluorescentê ve dişopîne, û encaman bi kêşeya floransê dadbar dike.Ew dikare bi alîkariya nirxa Cq û kurba standard were hejmartin.

Ji ber ku teknolojiya qPCR di pergalek girtî de pêk tê, îhtîmala vegirtinê kêm dibe, û sînyala fluorescence dikare ji bo tespîtkirina mîqdar were şopandin, ji ber vê yekê ew di pratîka klînîkî de ya herî berfireh tê bikar anîn û di PCR de bûye teknolojiya serdest.

Madeyên fluorescentê yên ku di PCR-ya mîqdar a fluorescentê ya rast-a-dem de têne bikar anîn dikarin li van dabeşan bêne dabeş kirin: TaqMan sondaya fluorescent, tîrêjên molekular û boyaxa fluorescent.

1) TaqMan sondaya fluorescent:

Di dema zêdekirina PCR de, dema ku cotek primerê lê zêde bike, sondayek fluorescentê ya taybetî tê zêdekirin.Lêpirsîn oligonukleotîdek e, û her du dawiya wan bi komek fluorescentê ya nûçegihan û komek fluorescent a quencher têne nîşankirin.

Dema ku sondaj saxlem be, sînyala floresentê ya ku ji hêla koma nûçegihanan ve hatî derxistin ji hêla koma quenching ve tê vegirtin;di dema zêdekirina PCR de, çalakiya 5'-3' exonukleazê ya enzîma Taq sondajê diqetîne û xera dike, koma fluorescentê ya nûçegîhanê dike û quncher dike. sînyala floransê bi pêkhatina hilbera PCR re bi tevahî hevdem e.

2) Rengê fluorescent SYBR:

Di pergala reaksiyonê ya PCR de, zêdeyî rengê SYBR fluorescent tê zêdekirin.Piştî ku boyaxa fluorescentê ya SYBR ne-taybetî di nav zencîra dualî ya ADNyê de tê bicîh kirin, ew îşaretek fluorescentê derdixe.Molekula boyaxa SYBR ya ku di zincîrê de nehêle dê ti îşaretek fluorescent dernexîne, bi vî rengî sînyala fluorescentê piştrast dike. Zêdebûna hilberên PCR bi zêdebûna hilberên PCR re bi tevahî hevdem e.SYBR tenê bi ADN-ya dubendî ve girêdide, ji ber vê yekê kêşeya helandinê dikare were bikar anîn da ku diyar bike ka reaksiyona PCR taybet e.

3) Çiraya molekular:

Ew sondayek oligonukleotidî ya du-labelkirî ya stem-loop e ku li 5 û 3 dawîn avahiyek porê bi qasî 8 bingehan pêk tîne.Rêzên asîda nukleîk ên li her du aliyan bi hev re têne hev kirin, ku dibe sedema ku koma florescent û koma qunçing teng bibin.Nêzîkî, dê fluorescence neyê hilberandin.

Piştî ku hilbera PCR-ê tê çêkirin, di dema pêvajoya helandinê de, beşa navîn a tîrêjê molekulî bi rêzek DNA ya taybetî re tête hev kirin, û gena fluorescent ji gena quncher tê veqetandin da ku floransê çêbike.

Dezawantajên sereke yên PCR-nifşa duyemîn:

Hesasiyet hîn jî kêm e, û tespîtkirina nimûneyên kêm-kopî nerast e.

Bandora nirxa paşerojê heye, û encam ji destwerdanê re gumanbar e.

Dema ku di pergala reaksiyonê de astengkerên PCR hene, encamên tespîtkirinê ji destwerdanê re gumanbar in.

Nifşa sêyemîn PCR dîjîtal

PCR dîjîtal (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) jimara kopî ya rêzika armancê bi vedîtina xala dawîn dihesibîne, û dikare bêyî karanîna kontrolên hundurîn û kelûpelên standard tespîtkirina mîqdar a bêkêmasî pêk bîne.

PCR dîjîtal tespîtkirina xala dawîn bikar tîne û bi nirxa Ct ve girêdayî nabe (berbihaya çerxê), ji ber vê yekê reaksiyona PCR-ya dîjîtal ji berkarhatina zêdekirinê kêmtir bandor dibe, û tolerasyona li hember astengkerên reaksiyona PCR, bi rastbûn û dubarebûnek bilind, çêtir dibe.

Ji ber taybetmendiyên hesasiyeta bilind û rastbûna bilind, ew bi hêsanî ji hêla astengkerên reaksiyonên PCR-ê ve nayê destwerdan, û ew dikare bêyî hilberên standard, ku bûye cîhek lêkolîn û serîlêdanê, pîvanek rastîn a rastîn bi dest bixe.

Li gorî formên cihêreng ên yekîneya reaksiyonê, ew dikare li sê celebên sereke were dabeş kirin: pergalên mîkrofluîdîk, çîp û dilopan.

1) PCR dîjîtal a mîkrofluîdîk, mdPCR:

Li ser bingeha teknolojiya microfluidic, şablonê DNA ji hev veqetandin.Teknolojiya mîkrofluîdîk dikare nimûneya nano-nûvekirin an nifşkirina dilopên piçûktir fam bike, lê dilop hewceyê rêbazek adsorpsiyonê ya taybetî ye û dûv re bi pergala reaksiyonê ya PCR re were hev kirin.mdPCR hêdî hêdî bi rêbazên din ve hatî veguheztin.

2) PCR dîjîtal-based droplet, ddPCR:

Teknolojiya hilberîna dilopên av-di-rûnê bikar bînin da ku nimûneyê di dilopan de bişopînin, û pergala reaksiyonê ya ku molekulên asîdên nukleîk vedihewîne bi hezaran dilopên nano-pîvanan dabeş bikin, ku her yek molekula mebesta asîdeya nukleîîk a ku were tespît kirin tune ye, an jî yek ji çend molekulên asîdên nukleî yên ku têne ceribandin hene.

3) PCR dîjîtal-based Chip, cdPCR:

Teknolojiya rêça şilavê ya yekbûyî bikar bînin da ku gelek mîkrotube û mîkrokavîteyên li ser pêlên silicon an cama quartz binivîsînin, û herikîna çareseriyê bi valavên kontrolê yên cihêreng kontrol bikin, û şilava nimûneyê li nanometerên heman mezinahîyê di nav bîrên reaksiyonê de dabeş bikin ji bo Reaksiyona PCR-ya dîjîtal da ku bigihîje pîvana bêkêmasî.

Dezawantajên sereke yên nifşa sêyemîn PCR:

Amûr û reagent biha ne.

Pêdiviyên kalîteya şablonê bilind in.Ger mîqdara şablonê ji mîqdara mîkrosîstemê derbas bibe, ew ê ne gengaz be ku were pîvandin, û heke ew pir hindik be, dê rastbûna hejmarbûnê kêm bibe.

Di heman demê de dema ku amplifikasyonek ne-taybetî hebe, pozîtîfên derewîn jî têne çêkirin.