COVID-19 nexweşiyek infeksiyonê ye ku ji hêla Coronavirus Tîpa 2 ya Sendroma Bêhnvedanê ya Zehmetî ve çêdibe. Dema ku mirov pê vegirtine, nîşaneyên herî gelemperî germ, kuxik û bêhnê ne.

Nimûneyên ku ji bo ceribandinê têne bikar anîn dikarin bi şikilên nasopharyngeal an şûşeyên oropharyngeal werin berhev kirin.

PCR çi ye?

Rêbaza standard a tespîtkirina coronavirus reaksiyona zincîra polîmerase, PCR e.Ev rêbazek bi berfirehî di biyolojiya molekular de tê bikar anîn.Ew dikare zû bi mîlyonan heta bi mîlyaran perçeyên DNA yên taybetî kopî bike.

Vîrûsa nû genomek RNA ya yek-zindî ya pir dirêj dihewîne.Ji bo tespîtkirina van vîrusan bi PCR, divê molekulên RNA ji hêla transkrîptaza berevajî ve veguherin rêzikên DNA yên temamker, û dûv re ADNya ku nû hatî sentezkirin dikare bi prosedurên standard PCR, ku bi gelemperî wekî RT-PCR tê zanîn, were zêdekirin.

Pêvajoya RT-PCR

Derxistina RNA

Ji bo pêkanîna vê rêbazê, di bingeh de divê RNAya vîrus were derxistin.Cûrbecûr kîtên paqijkirina RNA dikare ji bo veqetandina hêsan, bilez û bi bandor were bikar anîn.

Ji bo derxistina RNAya vîrusê bi karanîna kîteyek bazirganî, pêşî nimûneyê têxin lûleya mîkrosentrîfujê û dûv re wê bi tampona lîzê re tevlihev bikin.Ev tampon pir denatured e û bi gelemperî ji fenol û guanidine isothiocyanate pêk tê.Wekî din, înhîbîtorên RNase bi gelemperî di tampona lîzê de hene da ku veqetandina RNA ya viral a saxlem piştrast bikin.

Piştî ku tampona lîzê lê zêde bikin, lûleya tevlihevkirinê bi nebza dorpeç bikin û li germahiya odeyê bihêlin.Dûv re vîrus di bin şert û mercên pir denaturing ku ji hêla tampon lîzê ve têne peyda kirin tê lîz kirin.

Piştî ku nimûne tê lîzkirin, ji bo prosedûra paqijkirinê boriyek santrîfujê tê bikar anîn.Nimûne di lûleya santrîfujê de tê barkirin û piştre tê santrafûjkirin.

Ev prosedur rêbazek derxistina qonaxa zexm e ku tê de qonaxa rawestayî ji matrixek silica gel pêk tê.

Di bin şert û mercên herî baş ên xwê û pH de, molekulên ARNyê bi parzûna silicê ve girêdidin.

Di heman demê de, proteîn û qirêjên din têne rakirin.

Piştî santrîfujkirinê, lûleya santrîfujê têxin nav boriyek berhevkirinê ya paqij, filtratê bavêjin û dûv re tampon şuştinê lê zêde bikin.

Tûpê dîsa têxin nav santrîfujê da ku tamponê şuştinê di nav membranê de bi hêz bike.Ev ê hemî nepaqijiyên mayî ji parzûnê derxîne, tenê RNA bi gêla silica ve girêdayî bimîne.

Piştî ku nimûne tê şuştin, lûlê têxin nav boriyek mîkrosentrîfujê ya paqij û tamponê şuştinê lê zêde bikin.

Dûv re ew tê santrîfûj kirin da ku tamponê helandinê bi membranê ve bi zorê bike.Tampon helandinê RNAya vîrusê ji stûna spinê derdixe û RNAya paqijkirî ya bê proteîn, înhîbîtor û gemarên din werdigire.

GAV 2

Konsantreya tevlihev

Piştî derxistina RNAya vîrusê, gava paşîn amadekirina tevliheviya reaksiyonê ji bo zêdekirina PCR ye.Di vê gavê de, konsantre tê bikar anîn.Ev çareseriya konsantrekirî çareseriyek konsantrekirî ya pêşdibistanê ye ku ji pêşmiksek, transkrîptaza berevajî, nukleotîd, primera pêşde, berevajî, proba TaqMan û ADN polymerase pêk tê.

Di dawiyê de, ji bo temamkirina vê tevliheviya reaksiyonê, şablonê RNA tê zêdekirin.Tîp bi vortexkirina pêlhev têne tevlihev kirin, û dûv re tevliheviya reaksiyonê di nav plakaya PCR de tê barkirin.Di plakaya PCR de bi gelemperî 96 bîr hene û dikare di heman demê de gelek nimûneyan analîz bike.

GAV 3

Amplification PCR

Dûv re, plakaya di makîneya PCR-ê de, ku bi bingehîn çerxa germahiyê ye, bi cîh bikin.

RT-PCR-ya rast-a-dem ji bo tespîtkirina coronavirusê nû ya 2019-an bi zêdekirina rêzika armancê di gena RdrRP, gena E û gena N de tête bikar anîn.Hilbijartina genê armanc bi rêza pêşîn û lêkolînê ve girêdayî ye.

Pêngava yekem a RT-PCR veguherîna berevajî ye.Benda yekem a ADN-ya temamker tê sentezkirin, ku ji hêla PCR-ya reverse primer ve tê dest pê kirin, ku bi beşa temamker a genoma RNA ya vîrusê ve girêdide.Dûv re transkrîptaza berevajî nukleotîdên ADNyê li dawiya 3'ya primerê zêde dike da ku ADN-ya temamker a RNAya vîrusê sentez bike.Germahî û dirêjahiya vê gavê bi primers, ARN-ya armanc û transkrîptaza berevajî ve girêdayî ye.

Dûv re, pêngavek denaturasyonê ya destpêkê tê sepandin, ku di encamê de denaturasyona hîbrîdê RNA-DNA pêk tê.Ev gav ji bo çalakkirina DNA polymerase hewce ye.Di heman demê de, transkriptaza berevajî bêçalak dibe.

PCR ji rêze dewreyên germî pêk tê.Her çerxek ji denaturasyon, annealkirin û gavên dirêjkirinê pêk tê.

Pêngava denaturasyonê tê de germkirina odeya reaksiyonê heya 95 pileya Celsius û karanîna wê ji bo denaturasyona şablona ADN-ya dubendî ye.

Di pêngava paşîn de, germahiya reaksiyonê bi 58 pileya Celsius kêm dibe, ku rê dide pêşmergê pêşde ku beşa temamker a şablona xweya ADN-ê ya yek-zindî bişewitîne.Germahiya lêdanê rasterast bi dirêjahî û pêkhatina primerê ve girêdayî ye.

Di qonaxa dirêjkirinê de, DNA polîmeraz bendek DNA ya nû ku temamkerê şablonê ADN-ê ye hevrêz dike.Bi lêzêdekirina navokên belaş ên temamker ên şablonê di rêça 5' ber 3'an de ji tevliheviya reaksiyonê.Germahiya vê gavê bi DNA polîmeraza tê bikaranîn ve girêdayî ye.

Piştî çerxa yekem, hedefek DNA-ya dubendî tê bidestxistin.

Dûv re, têkeve çerxa duyemîn.ADN-ya dubendî ji bo du molekulên ADN-ê yên yek-zindî çêbibin, tê denaturîzekirin.

Di gava paşîn de, germahiya reaksiyonê tê xwarê, primers li her şablonek DNA-ya yek-zindî têne zevt kirin, û sondaya Taq-man li beşa temamker a ADN-ya mebestê tê vedan.

Lêkolîna TaqMan ji fluorophore kovalentî bi 5'dawiya sondaya oligonukleotidê ve girêdayî ye.Dema ku ji hêla çavkaniya ronahiyê ya cycler ve tê heyecan kirin, fluorophore floransence derdixe.Digel vê yekê, lêpirsîn di dawiya 3'yan de ji qunçerek pêk tê.Nêzîkbûna gena nûçegihanê bi quncherê re pêşî li tespîtkirina floransê digire.

Di qonaxa dirêjkirinê de, ADN polymerase zencîreyek nû çêdike.Dema ku polîmeraz digihêje sondaya TaqMan, çalakiya wê ya endojen a 5'nukleazê sondajê diqetîne, boyax ji qunçerê vediqetîne.

Bi her çerxa PCR-ê re, bêtir molekulên boyaxê têne berdan, û di encamê de bi zêdebûna tîrêjiya floransê re li gorî hejmara amplikonên hatine sentezkirin zêde dibe.

Ev rêbaz dihêle ku meriv hejmara rêzek diyarkirî ya di nimûneyê de texmîn bike.Hejmara parçeyên ADN-ê yên du-zindî di her dewrekê de duqat dibe.Ji ber vê yekê, PCR dikare ji bo analîzkirina nimûneyên pir piçûk were bikar anîn.

Ji bo pîvandina sînyala fluorescentê, çiraya halojen a tungstenê, parzûna heyecanê, refleksor, lens, parzûna belavbûnê û kameraya CCD-a amûrê-bikaranîna hevgirtî.

GAV 4 Detect

Ji bo pîvandina sînyala fluorescentê, çiraya halojen a tungstenê, parzûna heyecanê, refleksor, lens, parzûna belavbûnê û kameraya CCD-a amûrê-bikaranîna hevgirtî.

Ronahiya parzûnkirî ya lampê ji hêla refleksorê ve tê xuyang kirin, di lenseya kondensatorê re derbas dibe, û li navenda her qulikê tê balkişandin.Dûv re floresensa ku ji qulê derdikeve ji neynikê tê xuyang kirin, di parzûna belavbûnê re derbas dibe û ji hêla kamera CCD ve tê dîtin.Di her çerxa PCR de, ronahiya fluorophore ya xwe-heyecandî dikare ji hêla CCD ve were tesbît kirin.

Ew ronahiya hatî girtin vediguherîne daneyên dîjîtal.Ji vê rêbazê re PCR-a-time tê gotin, û ew rê dide çavdêriya rast-demê ya pêşkeftina reaksiyona PCR-ê.