Her kes li ser prensîba ceribandina qRT-PCR, sêwirana primer, şirovekirina encamê, hwd. diaxive, lê ez difikirim ku divê ez operasyona ceribandinê ya qRT-PCR bi we re parve bikim.Ew piçûk e, lê ew li ser encaman e.
Berî ku em qRT-PCR bikin, pêdivî ye ku em têgihiştinek zelal a RNA-ya xwe û rêbazên xebatê hebin.Beriya her tiştî, hewldanên me li şûna ku tenê pratîk bikin, ji bo bidestxistina encamê ne.Ji ber vê yekê berî ku qRT-PCR bikin, pêdivî ye ku em mijarên jêrîn destnîşan bikin (hin ji wan tenê ji bo SYBR-ê têne sepandin).
1 Ma hûn guman dikin ku ARNya we têk neçûye?
NanoDrop 2000 tenê dikare hûrbûn û paqijiya ARNyê teşhîs bike, lê nikare yekparebûna ARNyê tespît bike.
Nirxa ARN (Hejmara Intesîtê ya RNA) dikare yekparebûna RNA-yê ku ji hêla pergala Agilent 2100 Bioanalyzer ve tê tespît kirin nîşan bide.
Fig. Diyagrama şematîkî ya nirxên RIN ji bo nimûneyên RNA yên cihê (eukaryots)
Lêbelê, laboratîf bi gelemperî xwedan Agilent 2100 Bioanalyzer ne.Di vê rewşê de, em dikarin bi gêlê formaldehîdê vedîtin, lê hewcedariya ji bo mîqdara giştî ya RNA zêde ye, ji ber vê yekê rêbaza zûtirîn karanîna elektroforeziya gel a normal e.Pêdivî ye ku ew di hawîrdorek bê nukleaz de be, ji ber vê yekê pêdivî ye ku tanka elektroforez, şûşeya sol, berika gel û bi ava DEPC were şûştin.Agarose di heman demê de bê nukleaz e (heta ku ew nû vebe), û Tampona Barkirinê divê bi qasî ku gengaz be, bi 1,2% gêlê nû vebe.
Bala xwe bidinê ku divê gel bi tevahî were hilweşandin, wekî din ew ê bibe sedema bandên nehomojen, wekî ku di nimûneya 9-ê de di wêneyê de tê xuyang kirin.Ger voltaj pir zêde be an pir dirêj bixebite dê germê çêbike û bibe sedema hilweşîna RNA, ji ber vê yekê divê voltaj û dem bi rengek maqûl bêne kontrol kirin.Wekî din, xebitandina gel dikare bêtir diyar bike ka di nimûneyê de bermahiyên DNA-yê heye an na, û binihêre ka hejmareke mezin ji bendên girtî di bîra belavkirinê de hene.
Jimar.Tespîtkirina elektroforeziya gel a RNA
2 Ma hûn li ser hûrbûna cDNA-ya xwe ewle ne?
Tecrûbeya birayên mezin ên di laboratîfê de ev e ku cDNA ya pergala 20 ul ku bi her veguheztinê ve hatî wergirtin rasterast 20X tê rijandin, dema ku xwişkên post-doktorayê 10X têne rijandin.Ez bi gelemperî bi rewşê ve girêdayî ye.Ji ber ku qalîteya RNA ya ku ji hêla her kesî ve hatî destnîşan kirin cûda ye, asta vegerandinê jî cûda ye, û dibe ku teknolojiya berevajîkirinê ne aram be.
Ji ber vê yekê her gava ku ez cDNA-ya berevajî bistînim, ez ê pêşî wê bi qasî 3 carî rijandim, û dûv re jî gena malparêziyê bikar bînim da ku RT-PCR bikim, hejmara dewran bi gelemperî 25 çerx e, da ku berhevoka taybetî nas bike, û dûv re faktora dilopkirina paşîn diyar bikim.
3 Ma hûn guman dikin ku primerên we hêsan têne bikar anîn?
Ew dikare qursa helandinê ya qRT-PCR derbas bike, lê ev hîn jî drav dike.Ji bo laboratûwarên bê pere pir, gava ku ew gelek primers werdigirin, ew dikarin RT-PCR-ya asayî bikar bînin da ku bibînin ka ew band yek e û taybetmendiya prîmeran nas bikin.Ger laboratûar ne kêm be, taybetmendiya hemî arîmeran dikare carekê bi riya kevza helandinê were nas kirin.
4 Ma hûn pê ewle ne ku şert û mercên ceribandina we guncan in?
Pêdivî ye ku SYBR ji ronahiya bihêz were parastin, ji ber vê yekê dema ku reagenta SYBR lê zêde bikin hewl bidin ku ronahiya serrî vemirînin, û tenê hewce ye ku ronahiya qels bikar bînin da ku wê temam bikin.
SYBR di 4°C de hilînin.Dema ku tê bikar anîn, bi nermî jor û jêr bizivirînin da ku baş tevbigerin da ku kef nebin, û bi tundî negerin.
Hin xwişkên piçûk hez dikin ku nîşanan li ser panela PCR-ê bikişînin ji ber tirsa tevlihevkirina nimûneyan, ku ev xelet e.Ji ber ku nîşankerên we pir îhtîmal e ku bandorê li berhevoka sînyalên floransê bikin, ez bi gelemperî ji ciwanan re pêşniyar dikim ku notebookên ceribandinê bikar bînin da ku di bîranînê de bibin alîkar, wekî ku li jêr tê xuyang kirin.
Jimar.Diagrama barkirina nimûneya qRT-PCR
5 Ma hûn guman dikin ku hûn wê rast dikin?
Bê guman destanan li xwe bikin, destmalan li xwe bikin, destmalan li xwe bikin û sê caran tiştên girîng bibêjin.
Ji bo ku ronahiya SYBR li ber ronahiyê kêm bikim, ez bi xwe dixwazim pêşî şablonek lê zêde bikim, wekî ku di jimareya jêrîn de tê xuyang kirin.Li gorî ezmûnê, zêdekirina mîqdarek piçûk a şablonê dibe ku bibe sedema xeletiyên nimûneyê.Ji ber vê yekê, ji bo ku ez xeletiya ku ji ber lê zêdekirina piçûkek şablon çêdibe kêm bikim, ez bi gelemperî nimûneyê dîsa ducar dikim, û dema ku nimûneyê lê zêde dikim mîqdara ducar dikim da ku hêjeya H2O2 ya lê zêdekirî kêm bikim.
Jimar.Diyagrama şematîkî ya barkirina qRT-PCR
Dûv re pergala qRT-PCR wekî jêrîn mîheng bikin.
Jimar.Diagrama amadekirina pergala qRT-PCR
BİXWÎNE: Pêvajoya veavakirinê pêdivî ye ku li ser berfê were kirin.
Piştî lê zêdekirina nimûneyê, fîlima morkirina zelal bixin.Biceribînin ku bi destên xwe rûbera fîlima morkirina zelal nekevin, tenê ji cîhê li her du aliyên fîlimê bixebitin.Ji ber ku şopa tiliyan dibe ku bandorê li berhevkirina sînyalên fluorescentê jî bike.Dûv re santrîfujek bikar bînin da ku zû 10 seqeyan bi leza nizm santrîfuj bikin da ku rê li ber daliqandina nimûneyê li dîwêr bigirin.
Berhemên Têkildar:
Dema şandinê: Avrêl-28-2023
