Ezmûna RT-qPCR derxistina RNA û nirxandina kalîteyê, veguheztina berevajî û qPCR sê gavan vedihewîne, her gav gelek tedbîr hene, em ê li jêr bi hûrgulî destnîşan bikin.

Ⅰ.Nirxandina kalîteya RNA

Di ceribandina RT-qPCR de, piştî qedandina derxistina RNA, pêdivî ye ku kalîteya RNA were nirxandin, û ceribandina şopandinê tenê piştî ku ew qayîl bû dikare were kirin.Rêbazên nirxandinê spectrophotometer, Elektroforeza gel a Agilent, analîza Agilent 2100, ku di nav wan de spektrofotometera herî gelemperî tê bikar anîn û vedîtina rêbaza elektroforez a gel agarose pêk tê.Divê were zanîn ku pêdivî ye ku ev her du rêbaz bi hev re bêne bikar anîn da ku tespîtkirin û analîzkirina berhevok, pakî û yekitiya RNA-yê temam bikin, da ku kalîteya RNA were misoger kirin.

Kîta îzolekirina RNA ya têkildar: 

Kîta îzolekirina RNA ya tevhev

RNA-ya tevayî ya pir paqijkirî û bi kalîte dikare di 11 hûrdeman de ji hucreyên çandî yên cihêreng were wergirtin.

Animal Total Isolation RNA Kit

Zû û bikêrhatî RNA-ya tevahî ya paqijiya bilind û bi kalîte ji tevnên cûrbecûr yên heywanan derdixin.

Spectrophotometer:

Spektrofotometre bi giranî ji bo destnîşankirina hûrbûn û paqijiya RNA tê bikar anîn, lê ew nikare yekbûna RNA û bermahiyên genomîk tespît bike.Di nav wan de, A260/280 û A260/230 ji bo tespîtkirina paqijiya RNA pîvanên girîng in, û paqijiya RNA li gorî guheztina nirxên wan dikare were tespît kirin:

1. 1.92.1, ku hilweşîna qismî ya gengaz a RNA destnîşan dike, ku dikare bi elektroforeziya gel agarose ve bêtir were pejirandin.

2. 2.0

Elektroforeza gel agarose:

Vekolîna elektroforez a gêlê agarose dikare yekbûna RNA, genom û bermahiyên proteîn analîz bike, lê nekare bi durustî hûrbûna RNA-yê bihejmêre an bermahiyên reagentên organîk tespît bike.Mînak şablonên RNA yên eukaryotî bigirin:

1. ARN bi elektroforez gêla agarose hat kirin.Ger li ser nexşeya gêlê tenê sê bandên yekane yên 28sRNA, 18sRNA û 5.8sRNA hebin, ev nîşan dide ku ARNya ku hatiye derxistin saxlem e.Ger diyardeyek bikişînê hebe, ew hilweşîna qismî ya ARNyê nîşan dide.

2. Ger di navbera qulika benîşt û bandê 28sRNA de bendek geş hebe, dibe ku bermayiya DNA ya genomîk hebe.

3. Ger bend di qulika benîştê de xuya bibin, ev nîşan dide ku dibe ku bermahiyên proteîn û maddeyên makromolekuler ên din hebin.

Ⅱ. Reverse transkription

Piştî ku derxistina RNA qediya, pêdivî ye ku ew ji bo ceribandinên paşîn di cDNA-yê de were vegerandin, ji ber vê yekê gava vegerandinê pêdivî ye.Veguheztina berevajî dê ji bijartina transkriptaza berevajî û destpêk were destnîşan kirin:

Hilbijartina transkrîptaza berevajî:

Transkriptazên berevajî yên tîpîk AMV RTase û MMLV RTase hene.RNase H ya AMV RTase xwedan çalakiyek xurt, dirêjahiya senteza kurt, mîqdara sentezê ya kêm û aramiya germî ya baş e (42 ~ 55 ℃).Çalakiya RNase H ya MMLV RTase qels e, dirêjahiya sentezê dirêj e, mîqdara sentezê zêde ye, û aramiya termal qels e (37 ~ 42 ℃).

Ji ber ku enzîma RNase H xwedî fonksiyona hilweşandina şablonê RNA ye, MMLV bi çalakiya RNase H ya qels divê di dema veguheztina berevajî de bi bijartî were hilbijartin, û piştî endezyariya genetîkî ya paşîn, aramiya germî ya MMLV gihîştiye hêlînek kalîteyê.Foregene digirinForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV ji bo veguheztina berevajî) wek nimûne, ew transkrîptaza berevajî ya nû ye ku di bakteriyên endezyarkirî yên E. coli de bi karanîna teknolojiya ji nû vekombînasyona genetîkî ve hatî diyar kirin.Ew polîmerazek ADNyê ya vejenerekirî ye ku ji ARN, ADN, an hîbrîdek ARN:DNA ya yek-zindî zincîrek ADN-ya temamker sentez dike.Ew xwedan çalakiya RNase H, îstîqrara xurt, girêdana RNA ya bihêz, û hesasiyeta bilind a tespîtkirinê tune.

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV ji bo veguheztina berevajî)

Hilbijartina primer:

Bi gelemperî primerên RT di sê kategoriyan de cih digirin: oligo dT, primerên rasthatî, û primerên gen-taybetî.Li gorî hewcedariyên ceribandî yên cihêreng, primerên maqûl hilbijêrin.

1. Ger şablon bi eslê xwe eukaryotî be û cDNA-ya dereng ji bo zêdekirina PCR-ya rûtîn were bikar anîn, Oligo (dT) tê pêşniyar kirin;Ger ceribandina paşîn tenê ji bo qPCR were bikar anîn, Oligo (dT) tê pêşniyar kirin ku bi primerên rasthatî re were tevlihev kirin da ku kargêriya veguheztina berevajî baştir bike.

2. Ger şablon ji prokaryotan be, divê Primerên Random an jî primerên taybetî yên genê ji bo veguheztina berevajî werin hilbijartin.

Ⅲ.qPCR

Pîvana fluorescence bi piranî ji hilbijartina rêbazên mîqdar, prensîbên sêwirana primer, hilbijartina ROX, veavakirina pergala reaksiyonê û mîhengkirina şertên reaksiyonê, hwd.

Hilbijartina rêbazên hejmarî:

Rêbazên mîqdar li ser rêbazên mîqdar ên nisbî û rêbazên mîqdar ên mutleq têne dabeş kirin.Hêjdarkirina têkildar dikare were bikar anîn da ku bandora hin rêbazên dermankirinê li ser vegotina genê tespît bike, cûdahiya vegotina genê di demên cûda de tespît bike û cûdahiya vegotina genê di tevnên cihê de bide ber hev.Pîvana bêkêmasî dikare mîqdara asîda nukleîk a di vîrusê de û hwd.Dema ku ceribandinan dikin, divê em li gorî ceribandinên xwe rêbazên mîqdar ên guncan hilbijêrin.

Prensîbên sêwirana Primer:

Sêwirana primer ji bo qPCR rasterast bi karbidestiya amplification û taybetmendiya hilberê ve girêdayî ye.Ji ber vê yekê, sêwirana rast a pêşbirkên baş gava yekem a qPCR serketî ye.Di sêwirana primerê de, dema ku prensîba sêwirana pêşîn a konvansiyonel bicivîne, divê li prensîbên jêrîn bala xwe bidin:

1. Dirêjahiya perçeya armancê di navbera 100 û 300 bp de tê kontrol kirin;

2. Sêwirana cross-exon ku ji bandora DNA ya genomîk dûr bikeve;

3. Pêdivî ye ku primerên sêwirandî ji bo karbidestiya zêdekirinê bêne ceribandin, û tenê dema ku karbidestiya zêdekirinê bigihîje standardê (% 90-110) dikarin ji bo ceribandinên mîqdar bêne bikar anîn;

4. Kêmbûna Primer bi gelemperî di navbera 0.1uM û 1.0uM de xweşbîn e.

HilbijartinaROX:

Di pêvajoya reaksiyonê ya mîqdar de, ROX dikare cûdahiya riya optîkî, xeletiya pipetkirinê an cûdahiya volumê ya ku ji ber evaporasyon û kondensasyonê bi yekdengî çêdibe rast bike, dubarebûna encaman baştir bike.Lêbelê, divê were zanîn ku hilbijartina ROX bi amûreyê ve girêdayî ye.Ger amûra qPCR fonksiyona rastkirina ferqa di navbera qulan de bixweber heye, ew ne hewce ye ku ROX lê zêde bike;Wekî din, ew hewce dike ku rastkirina ROX zêde bike.Di kirîna reagentan de hevkarên piçûk divê li gorî amûra ku ji bo bijartina ROX-a rast tê bikar anîn bin, ji xeletiyên paşîn dûr bisekinin.

Amadekirina pergala reaksiyonê:

Hêjmarên reaksiyonê yên 20ul û 50ul têne tercîh kirin.Dema ku pergal tê formulekirin divê balê bikişîne ser mijarên jêrîn:

1. Pêdivî ye ku pergala reaksiyonê ji hêla hewayê ve di qada xebatê ya pir paqij, ddH-ya nû de were amadekirin₂O ji bo her ceribandinê tê bikaranîn;

2. Her ceribandinek pêdivî ye ku NTC amade bike da ku verast bike ka di pergalê de qirêjî heye, û her cotek primers pêdivî ye ku dema amadekirina pergalê NTC bike;

3. Ji bo tespîtkirina ka di şablonê RNA de bermayiya gDNA heye yan na, ji bo her nimûneyê NRT dikare ji bo tespîtkirinê were amadekirin;

4. Dema amadekirina pergalê, tê pêşniyar kirin ku ji bo yek nimûne herî kêm 3 dubareyên teknîkî bikin;

5. Dema ku şablon cDNA ye, tê pêşniyar kirin ku 5-10 carî were rijandin da ku bandora astengkirina pergala veguheztina berevajî ya li ser ceribandina qPCR kêm bike.Çêtir e ku meriv mîqdara şablonê ji hêla gradientê ve bikole, da ku nirxa CT di navbera 20-30 de bikeve;

6. Hejmara reaksiyonên pêwîst diyar bikin, li ser bingeha hejmara reaksiyonên 5-10% zêde bikin, û hejmara veavakirina volmê hesab bikin;

7, pergal bi karanîna prensîba premiksê tê amadekirin, piştî santrafûjasyonê tevdigere û pê ewle dibe ku gulçîn tune;

8, Bi qasî ku gengaz be hilbijarkên piştgirî hilbijêrin.

Kit RT-qPCR têkildar