Taybetmendiya tespîtkirinê
Di pir rewşan de, armanca sêwirana primer ew e ku taybetmendiya PCR-ê zêde bike.Ev ji hêla bandora kêm-zêde pêşbînbar a gelek guherbaran ve tê destnîşankirin.Yek guherbarek girîng rêza li 3'dawiya primerê ye.
Ya girîng, vekolînên PCR yên ku ji bo taybetmendiyê hatine sêwirandin bi îhtîmalek mezin e ku li ser rêgezek dînamîkî ya fireh karbidestiya bilind bidomînin, ji ber ku vekolîn hilberên zêdekirina ne-taybetî çê nake, bi vî rengî bi reagentên PCR re pêşbaziyê dike an reaksiyona mezinkirina sereke asteng dike.
Bê guman, di hin rewşan de, taybetmendî ne ya herî girîng e, ji bo nimûne, dema ku armanc ew e ku meriv ji nêz ve girêdayî lê pathogenên cihêreng bihejmêre, sêwirana taybetî, xweşbînkirin û standardên verastkirinê hewce ne.
Kevirê helandinê rêbazek standard e ji bo nirxandina taybetmendiya amplikonan, bi kêmanî di warê zêdekirina armancek yekane de.Lêbelê, pêdivî ye ku were balkişandin ku kelûpelên helandinê dikarin xapandin bin ji ber ku, mînakî, ew dikarin ji bandorên hevgirtî yên primerên nebaş û hûrgelên şablonê kêm bandor bibin.
P5 |Kevirê helandinê guheztinên Tm yên ku ji du vedîtina mîqdarên cihêreng ên du DNA-yên armanc têne wergirtin nîşan dide.
A. Di tansiyonên bilind de (ad)), piştî ku pîvana qPCR qediya, dimera yekem a diyar tune.Gava ku hûrbûna şablonê dadikeve 50 kopiyan (e), hilberek netaybet dest pê dike û di konsantasyona herî nizm de dibe hilberek yekane (f).
B. Di îmtîhanê de heman Tms di hemî hûrgelên armanc de tomar kir, û di konsantasyona herî nizm de jî dimera yekem a eşkere tune bû (5 kopî).Dema ku van her du rêbazên tespîtkirinê bikar tînin, di NTC-yan de ti hilberên amplifikasyonê nehatin dîtin.
P5 kelûpelên hilweşandinê yên ku bi nimûneyên ku tê de şablon di tansiyonên cihêreng de heye nîşan dide.P 5a nîşan dide ku di du tansiyonên herî nizm de, Tms ya hilberên amplifikasyonê yên ne-taybetî yên ku têne hilberandin ji ya amplikonên taybetî kêmtir in.
Eşkere ye ku ev rêbaza tespîtkirinê bi pêbawer nikare were bikar anîn ji bo tespîtkirina armancên ku di tansiyonên kêm de hene.
Balkêş e, NTC, ango nimûneyên ku bi tevahî DNA tune ne, hilberên zêdekirina (ne-taybetî) tomar nekirin, ku destnîşan dike ku DNA genomîk a paşîn dikare beşdarî zêdekirin/polîmerîzasyona ne-taybet bibe.
Carinan pêşbirkên paşerojê yên weha û zêdekirina ne-taybetî nayên çareser kirin, lê bi gelemperî gengaz e ku meriv rêbazek tespîtkirinê ku di her berhevoka şablonê û NTC de xwedan zêdekirina ne-taybetî nebe (P 5b) were sêwirandin.
Li vir, tewra tomarkirina zêdekirina berhevoka armancê bi Cq-ya 35-ê jî dê kelekek hilweşandinê ya taybetî çêbike.Bi heman rengî, NTC-ê nîşanên zêdekirina ne-taybetî nîşan nedan.Carinan, dibe ku tevgera tespîtkirinê bi vexwarina dayikê ve girêdayî be, û tenê zêdekirina ne-taybetî di hin pêkhateyên tamponê de, ku dibe ku bi hûrguliyên cûda yên Mg2+ re têkildar be, tê tespît kirin.
Îstiqrara tespîtê
Optimîzasyona Ta di pêvajoya verastkirin û xweşbîniya ampîrîkî ya tespîtkirina qPCR de gavek kêrhatî ye.Ew bi nîşandana germahiyê (an rêza germahiyê) ya ku Cq-ya herî nizm çêdike bêyî ku NTC-ê zêde bike, nîşanek rasterast a pêbaweriya primerê dide.
Cûdahiya du-çar-caran di hesasiyetê de dibe ku ji bo mirovên xwedan îfadeya mRNA ya bilind ne girîng be, lê ji bo ceribandinên tespîtkirinê, dibe ku ew cûdahiya di navbera encamên neyînî yên erênî û derewîn de be.
Taybetmendiyên Ta yên prîmerên qPCR dikarin pir cûda bibin.Hin ceribandin ne pir zexm in, û heke ew di bin nirxa Taya ya herî baş a primers de neyên kirin, ew ê zû hilweşin.
Ev girîng e ji ber ku ev celeb tespît bi gelemperî di cîhana rastîn de pirsgirêk e, û paqijiya nimûneyê, hûrbûna DNA, an hebûna DNA-ya din dibe ku ne çêtirîn be.
Wekî din, dibe ku hejmara kopiya armancê di navberek berfireh de cûda bibe, û reagent, amûrên plastîk, an amûr dikarin ji yên ku dema sazkirina ceribandinê têne bikar anîn cûda bin.
P|
A. Bioline's Sensifast SYBR mastermix (hejmara katalogê BIO-98050) bikar bînin da ku PCR-ya li ser cDNA-ya ku ji RNA mejiyê mirovan hatî amadekirin pêk bînin.
B. Amûra Bio-Rad's CFX qPCR bikar bînin da ku nexşeya mezinbûnê û kêşeya belavbûna apalene tomar bikin (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
C. Grafika zêdekirinê û kêşana helandinê ya ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. Grafika zêdekirin û kêşana hilweşandinê ya GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCTCTCGTGGATCTTC).
E. Cqs di germahiyên cuda yên annealkirinê de têne tomar kirin, cûdahiya di Cq de ku di binê germahiya 7C de hatî tomar kirin nîşan dide.
P 6 encamek tîpîk a ceribandinek nexwestî nîşan dide, li wir qPCR bi karanîna gradient Tas di navbera 59C û 67C (P 6a) de hate çêkirin, ku ji bo sê genên taybetî yên mêjiyê mirovan primer bikar tîne.
Ji grafika zêdekirinê tê dîtin ku primerên Opalin ji îdealê dûr in ji ber ku rêza wan a çêtirîn Ta pir teng e (Wêne 6b), ango Cq bi berfirehî têne belav kirin, di encamê de Cq bi girîngî bi Cqs Low-a xweya çêtirîn re tê berhev kirin.
Ev rêbaza tespîtkirinê bêîstîqrar e û dibe ku bibe sedema zêdekirina nebaş.Ji ber vê yekê, ev cotek primers divê ji nû ve were sêwirandin.Digel vê yekê, analîza keviya helandinê (navdêr) nîşan dide ku taybetmendiya vê rêbazê tespîtkirinê jî dibe ku pirsgirêk be, ji ber ku keviya helandinê ya her Ta cûda ye.
Rêbaza tespîtkirina ACSBG1 ku di P 6c de hatî destnîşan kirin ji rêbaza tespîtkirina Opalin ya li jor bihêztir e, lê ew hîn jî ji îdealê dûr e, û îhtîmal e ku ew were çêtir kirin.
Lêbelê, em tekez dikin ku di navbera zexm û taybetmendiyê de pêwendiyek pêwîst tune, ji ber ku kêşeya hilweşandinê ya ku bi vê rêbazê vedîtinê hatî hilberandin di hemî Tas (navdêr) de heman nirxa lûtkeyê nîşan dide.
Ji hêla din ve, ceribandina zexmbûnê pir tolerant e, Cq-yên wekhev di cûrbecûr Tas-ê de hilberîne, wekî ku di testa GFAP de di P 6d de hatî destnîşan kirin.
Cûdahiya di Cq-ên ku di heman rêza 8 pileyên Celsius de têne wergirtin ji 1 kêmtir e, û kêşeya hilweşandinê (navdêr) taybetmendiyên tespîtkirinê di vê rêza germahiyê de piştrast dike.Hêjayî gotinê ye ku Tas-ya hesabkirî û rêjeya Ta-ya rastîn dibe ku pir cûda bin.
Gelek rêwerz hene ku ji bo alîkariya lêkolîneran di sêwirana primerên bikêrhatî de hatine sêwirandin, ku piraniya wan li ser bingehên qaîdeyên demdirêj hatine damezrandin û gelek bal kişandiye ser 3'dawiya primers.Pir caran tê pêşniyar kirin ku G an C li dawiya 3' û du bingehên G an C (GC-clamp), lê ji 5 bingehên paşîn ji duyan zêdetir nebe.
Di pratîkê de, ev rêbaz dikarin lêkolîneran rêber bikin, lê ew ne hewce ne ku di her şert û mercan de rast in.
P7 |3'dawiya primerê bandorek hindik li ser taybetmendî an karîgeriyê dike.
A. Cihê primerên ji bo gena HIF-1α (NM_181054.2) mirovî.
B. Agilent Brilliant III SYBR vexwarina dayika kesk (Kat. No. 600882) bikar bînin da ku şeş tiştên ceribandinê zêde bikin.
C. Grafika zêdekirinê û kêşa helandinê ku ji hêla amûra CFX qPCR ya Bio-Rad û primerên 3'end ve hatî tomar kirin.NTC bi sor têne xuyang kirin.
D. tomar Cqs ji her babete test
Mînakî, encam di P 7 de bi qaîdeya 3'dawî re dijberî dike.Hemî sêwiran di bingeh de heman encaman derdixînin, bi tenê du berhevokên pêşîn ên ku di NTC de berbi zêdekirina ne-taybetî ve diçin.
Lêbelê, em nekarin bandora klîpa GC piştgirî bikin, ji ber ku di vê rewşê de, karanîna A an T wekî herî zêde 30 bingeh taybetmendiyê kêm nake.
Testa C, li cihê ku primera F di GGCC-yê de bi dawî dibe, Cqs di NTC-yan de tomar kir, û destnîşan kir ku dibe ku meriv bixwaze ji van rêzikên di dawiya 30-an de dûr bixe.Em tekez dikin ku yekane awayê destnîşankirina rêzika 3'dawî ya herî baş a cotek destpêk ev e ku meriv bi ceribandinê hin primerên berendam binirxîne.
Karbidestiya Amplification
Ya girîng, her çend tespîtkirina PCR-ya ne-taybetî çu carî nikare bibe taybetî, bi guheztina enzîm, vexwarina dayikê, lêzêde û şert û mercên bisiklêtê re karbidestiya zêdekirinê dikare bi gelek awayên cihêreng were sererast kirin û herî zêde.
Ji bo nirxandina karbidestiya tespîtkirina PCR, çêtirîn e ku meriv dirûvek serial a 10 an 5 carî ji asîdeya nukleîîk a armancê, ango "rêbaza qurmê standard" bikar bîne.
Ger amplikonên PCR an hedefên DNA yên sentetîk ji bo afirandina kêşek standard têne bikar anîn, divê dirûvên rêzikên van armancan bi hejmarek domdar a ADN-ya paşerojê (wek ADNya genomîk) re bêne tevlihev kirin.
P8 |Kevirê dilution ji bo nirxandina kargêriya PCR.
A. Ji bo HIF-1 primerên bikar bînin: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA û R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC û Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (hejmara katalogê 600882) ji bo PCR û şert û mercên kelikê helandinê.
B. 100 ng RNA berevajî hat transkrîbekirin, 2 caran hat rijandin, û nimûneyên cDNA yên rêzikirî 5 caran ji 1 ng DNAya genomî ya mirovî re hatin rijandin.Kevirê helandinê di navberê de tê xuyang kirin.
C. Ji bo nimûneya cDNA-ya duyemîn reaksiyona RT, helandin, û rijandina rêzê hate dubare kirin, û encam wekhev bûn.
P 8 du kelûpelên standard nîşan dide, ku li ser du nimûneyên cDNA yên cihêreng heman rêbaza vedîtinê bikar tîne, encam heman karîgerî ye, bi qasî 100%, û nirxa R2 jî dişibihe, ango, dereceya lihevhatinê di navbera daneyên ceribandinê û xeta regresyonê de an Rêjeya rêzê ya daneyê.
Herdu kelûpelên standard hevber in, lê ne tam yek in.Ger mebest ew e ku meriv bi rast hejmartina armancê be, divê were zanîn ku bêyî ravekirina nediyariyê nayê pejirandin ku hesabek hejmarê kopî were peyda kirin.
P9 |Nezelaliya pîvandinê ya ku bi mîqdarbûnê re bi karanîna kelek standard ve girêdayî ye.
A. Ji bo GAPDH (NM_002046) primerên bikar bînin da ku şertên PCR û helandinê pêk bînin.F: ACAGTTGCCATGTAGACC û R: TAACTGGTTGAGCACAGG û Bioline's Sensifast SYBR mastermix (hejmara katalogê BIO-98050).
B. Nexşeya zêdekirinê, çîçeka helandinê û qertafa standard bi amûra CFX qPCR ya Bio-Rad hatî tomar kirin.
C. Grafika kemera standard û 95% navbera pêbaweriyê (CI).
D. Hejmara kopî û 95% navbera pêbaweriyê ya sê nirxên Cq-ê yên ku ji kêşeya dilûkê têne derxistin.
P 9 destnîşan dike ku ji bo ceribandinek xweşbînkirî, guhezbariya xwerû ya kelek standardek yekane bi qasî 2 carî ye (95% navbera pêbaweriyê, herî kêm heya herî zêde), ku dibe ku guhezbariya herî piçûk a ku dikare were hêvî kirin be.
Hilbera têkildar:
Dema şandinê: Sep-30-2021
