RT-qPCR ji teknolojiya PCR ya asayî hatî pêşve xistin.Ew kîmyewiyên fluorescentê (rengên fluorescent an sondajên fluorescentê) li pergala reaksiyonê ya kevneşopî ya PCR zêde dike, û li gorî mekanîzmayên wan ên ronahiyê yên cihêreng pêvajoya helandin û dirêjkirina PCR-ê di wextê rast de tespît dike.Guhertinên sînyala fluorescentê di navgîniyê de têne bikar anîn da ku di her çerxa PCR-ê de mîqdara guherîna hilberê were hesibandin.Heya nuha, rêbazên herî gelemperî rêbaza rengê fluorescent û rêbaza lêpirsînê ne.

Rêbaza boyaxa fluorescent:
Hin boyaxên floransentê, wek SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, hwd., bi serê xwe ronahiyê dernaxin, lê piştî ku bi xêza piçûk a dsDNA ve girêdidin, floransê derdixin.Ji ber vê yekê, di destpêka reaksiyona PCR de, makîneyek nikare nîşana fluorescentê bibîne.Dema ku reaksîyon ber bi pêvekirin-dirêjkirinê (rêbaza du-gavekî) an qonaxa dirêjkirinê (rêbaza sê-gavekî) ve diçe, di vê demê de zincîreyên ducar têne vekirin, û DNA polîmeraza nû Di dema senteza zincîreyê de, molekulên floransent di hêlîna piçûk a dsDNA de têne hev kirin û floransence derdixin.Her ku hejmara çerxên PCR zêde dibe, her ku diçe zêdetir reng bi dsDNA re tevdigerin, û sînyala fluorescent jî bi domdarî zêde dibe.Wek mînakek SYBR Green Ⅰ.
Rêbaza lêkolînê:
Sondaya Taqman sondaya hîdrolîzê ya ku herî zêde tê bikar anîn e.Di dawiya 5'ya sondajê de, bi gelemperî FAM, komek fluorescent heye.Vekolîn bi xwe rêzek temamkerê gena armancê ye.Li dawiya 3'ya florforê komek qunçkirina fluorescentê heye.Li gorî prensîba veguheztina enerjiya rezonansê ya floransê (Förster veguheztina enerjiya rezonansê, FRET), dema ku koma fluorescentê ya nûçegihan (molekula fluorescentê ya xêrxwaz) û koma fluorescentê ya qutkirî (molekula fluorescentê ya qebulker) dema ku spektruma heyecanê li ser hev be û dûrahiya 7-10 pir nêzîk be fluoresansa molekula qebûlker, dema ku otofluoresans qels dibe.Ji ber vê yekê, di destpêka reaksiyona PCR de, dema ku sondaj di pergalê de azad û saxlem be, koma fluorescentê ya nûçegihan dê floransê dernexîne.Dema ku dişewitîne, aşît û sond bi şablonê ve girêdidin.Di qonaxa dirêjkirinê de, polîmeraz bi domdarî zincîreyên nû çêdike.ADN polymerase xwedan çalakiya exonuclease 5'-3' ye.Dema ku bigihêje sondayê, ADN-yê polîmeraz dê sondayê ji şablonê hîdrolîz bike, koma fluorescentê ya nûçegihan ji koma fluorescentê quencher veqetîne, û sînyala fluorescentê berde.Ji ber ku di navbera sondajê û şablonê de têkiliyek yek-bi-yek heye, rêbaza sondajê ji hêla rastbûn û hesasiyeta ceribandinê ve ji rêbaza boyaxê bilindtir e.

Fig 1 Prensîba qRT-PCR

Design Primer
Prensîb:

Pêdivî ye ku primers li devera parastî ya rêzikên asîda nukleîîk werin sêwirandin û xwedan taybetmendî bin.

Baştir e ku meriv rêzika cDNA bikar bîne, û rêzika mRNA jî tê pejirandin.Ger na, sêwirana herêma cds-ê ya rêzika DNA-yê bibînin.
Dirêjahiya hilbera mîqdar a fluorescent 80-150 bp, ya herî dirêj 300 bp e, dirêjahiya primerê bi gelemperî di navbera 17-25 bingehan de ye, û ferqa di navbera primerên jorîn û jêrîn de ne pir mezin be.

Naveroka G + C di navbera 40% û 60% de ye, û 45-55% çêtirîn e.
Nirxa TM di navbera 58-62 dereceyan de ye.
Biceribînin ku xwe ji dimer û xwe-dimeran dûr bixin, (ji 4 cot bingehên temamker ên li pey hev bêtir xuya nekin) strukturên porê, ger neçar be, bikin ΔG<4,5kJ/mol* Heke hûn nikaribin piştrast bikin ku gDNA di dema transkrîpsiyona berevajî de Paqij hatiye rakirin, çêtir e ku hûn primerên herêmê "3, dawîn biguherînin, T-yên ku nebin întron" têne sêwirandin. /C, A/G avahiya domdar (2-3) destpêk û ne-
taybetî Homolojiya rêzika heterojen a zêdekirî bi tercîhî ji %70 kêmtir e an jî 8 homologiya bingehîn a temamker heye.
Database:
CottonFGD li gorî peyvan lêgerîn
Sêwirana Primer:
Sêwirana pêşîn a IDT-qPCR

Fig2 IDT rûpela amûra sêwirana serhêl a primer

Nîşandana rûpela encamê ya Fig3
Sêwirana destpêkên lncRNA:
lncRNA:heman gavên wek mRNA.
miRNA:Prensîba rêbaza stem-loop: Ji ber ku hemî miRNA rêzikên kurt ên bi qasî 23 nt in, vedîtina rasterast a PCR nikare were kirin, ji ber vê yekê amûra rêzika stem-loop tê bikar anîn.Rêzeya stem-loop ADNyek yek-zindî ya bi qasî 50 nt e, ku dikare bi serê xwe strukturek porê çêbike.3 'Dawiya dawî dikare wekî rêzek temamkerê perçeya parçeyî ya miRNA were sêwirandin, wê hingê miRNA-ya armanc dikare di dema veguheztina berevajî de bi rêzika stem-loop ve were girêdan, û dirêjahiya giştî dikare bigihîje 70bp, ku bi dirêjahiya hilbera zêdekirî ya ku ji hêla qPCR ve hatî destnîşankirin ve girêdayî ye.Sêwirana pêşîn a miRNA ya dûvik.
Tespîtkirina taybetî-amplification:
Databasa teqîna serhêl: CottonFGD ji hêla wekheviya rêzikê ve teqiya
Teqîna herêmî: Binêrin ku Blast + bikar bînin ku teqîna herêmî bikin, linux û macos dikarin rasterast danegehek herêmî saz bikin, pergala win10 jî piştî sazkirina ubuntu bash dikare were kirin.Databasa teqîna herêmî û teqîna herêmî biafirînin;li ser win10 ubuntu bash veke.
Hişyarî: Pembûya jorîn û pembûya girava deryayê çandiniyên tetraploîd in, ji ber vê yekê encama teqînê dê bi gelemperî du an jî zêdetir bihevre be.Di paşerojê de, karanîna NAU cds wekî databasek ji bo pêkanîna teqînê dibe ku du genên homolog bi tenê çend cûdahiyên SNP bibînin.Bi gelemperî, du genên homolog bi sêwirana pêşîn ve nayên veqetandin, ji ber vê yekê ew wekî hev têne derman kirin.Ger indelek eşkere hebe, primerê bi gelemperî li ser indelê tê sêwirandin, lê dibe ku ev bibe sedema avahiyek duyemîn a primerê. Enerjiya belaş bilind dibe, dibe sedema kêmbûna karîgeriya zêdekirinê, lê ev yek neçar e.

Tespîtkirina avahiya duyemîn a pêşîn:
Gavên:veke oligo 7 → rêza şablonê têketinê → jêr-paceyê bigire → hilanînê → li ser şablonê cîhê destpêkê bibîne, ctrl+D bikirtînin da ku dirêjahiya primerê destnîşan bikin → strukturên cûrbecûr yên duyemîn analîz bikin, wek laşê xwe-dimerîzekirinê, heterodîmer, porê porê, nelihevkirin, hwd.Encama primera pêşîn baş e, strukturek dimer û porê diyar tune, bingehên temamker ên domdar tune, û nirxa bêkêmasî ya enerjiya belaş ji 4,5 kêmtir e, dema ku aşîkara paşîn berdewam nîşan dide 6 bingeh temamker in, û enerjiya belaş 8,8 e;ji bilî vê, dimereke cidîtir li dawiya 3' xuya dike, û dimerek ji 4 bingehên li pey hev xuya dike.Her çend enerjiya belaş ne zêde be jî, 3 'dimer Chl dikare bi ciddî bandorê li ser taybetmendiya amplifikasyonê û karbidestiya zêdekirinê bike.Digel vê yekê, pêdivî ye ku meriv porê porê, heterodîmer û nehevhatinan kontrol bike.

Encamên tespîtkirina Fig3 oligo7
Tespîtkirina karîgeriya amplification:
Bandora zêdekirina reaksiyona PCR bi giranî bandorê li encamên PCR dike.Di heman demê de di qRT-PCR de, karbidestiya zêdekirinê bi taybetî ji bo encamên mîqdar girîng e.Di tampona reaksiyonê de madeyên din, makîne û protokolên din derxînin.Qalîteya primeran di heman demê de bandorek mezin li ser kargêriya zêdekirina qRT-PCR jî heye.Ji bo ku rastbûna encaman were misoger kirin, hem pîvana floransê ya têkildar û hem jî pîvana floransê ya bêkêmasî pêdivî ye ku karbidestiya zêdekirina arîmeran tespît bike.Tê zanîn ku karîgeriya xurtkirina qRT-PCR di navbera 85% û 115% de ye.Du rêbaz hene:
1. Rêbaza kemera standard:
yek.CDNA tevlihev bikin
b.Dilution Gradient
c.qPCR
d.Wekheviya regresyonê ya xêz ji bo hesabkirina karîgeriya zêdekirinê
2. LinRegPCR
LinRegPCR bernameyek e ji bo analîzkirina Daneyên RT-PCR-ê yên dema rast, ku jê re daneya PCR (qPCR) ya mîqdar jî tê gotin ku li ser bingeha SYBR Green an kîmya mîna wê ye.Bername daneya rastkirî ya ne-bingehîn bikar tîne, li ser her nimûneyek Veqetandî sererastkirinek bingehîn pêk tîne, pencereyek-xêzbûnê destnîşan dike û dûv re analîza regresyonê ya xêzkirî bikar tîne da ku di nav koma daneya PCR-ê de xêzek rasterast bicîh bîne.Ji lingê vê xetê, karîgeriya PCR ya her nimûneyek kesane tê hesibandin.Rêjeya navînî ya PCR-ê ya her amplikonê û nirxa Ct ya her nimûneyê têne bikar anîn da ku berhevokek destpêkê ya her nimûneyê were hesibandin, ku di yekîneyên fluoresence yên kêfî de têne diyar kirin.Ketin û derketinê daneyê bi peldankek Excel ve ye.Tenê nimûne
tevlihevkirin hewce ye, ne gradient
gavên pêwîst in:(Bole CFX96 wekî mînakek bigirin, ne bi tevahî makîneya bi ABI zelal)
ceribandinî:ew ceribandinek qPCR standard e.
Derketina daneya qPCR:LinRegPCR dikare du formên pelên derketinê nas bike: RDML an Encama zêdekirina pîvanê.Bi rastî, ew nirxa rast-dema vedîtina jimareya dewrê û nîşana floransê ya ji hêla makîneyê ve ye, û amplifikasyon bi analîzkirina nirxa guheztina floransê ya kargêriya beşa xêzkirî tê wergirtin.
Hilbijartina daneyan: Di teoriyê de, nirxa RDML divê were bikar anîn.Tê texmîn kirin ku pirsgirêka komputera min ev e ku nermalavê nikare RDML nas bike, ji ber vê yekê min nirxa derketina excel wekî daneyên orîjînal heye.Pêşniyar kirin ku pêşî lêdana daneyan bi tundî were kirin, wek têkçûna zêdekirina nimûneyan, hwd. Di daneyên derketinê de xal dikarin werin jêbirin (bê guman, hûn nikarin wan jêbikin, LinRegPCR dê di qonaxa paşîn de van xalan paşguh bike)

Fig5 hinartina daneya qPCR

Fig6 hilbijartina nimûneyên berendam

Ketina daneyê:Results.xls zêdekirina kalîteyê veke, → LinRegPCR veke → pel → ji excelê bixwîne → parametreyên wekî ku di Figure 7-ê de têne xuyang kirin hilbijêrin → OK → bikirtînin diyarkirina rêzikên bingehîn

Fig7 gavên têketina daneya linRegPCR

Netîce:Ger dubare nebe, komkirin ne hewce ye.Ger dubarekirin hebe, komkirin dikare di koma nimûneyê de were guherandin, û navê genê di nasnameyê de tê nivîsandin, û paşê heman gen dê bixweber were kom kirin.Di dawiyê de, li ser pelê bikirtînin, excel derxînin, û encaman bibînin.Berbiçavkirina zêdekirinê û encamên R2 yên her bîrê dê bêne xuyang kirin.Ya duyemîn, heke hûn li koman dabeş bikin, dê karîgeriya navînî ya rastkirî were xuyang kirin.Piştrast bikin ku karbidestiya zêdekirina her primer di navbera 85% û 115% de ye.Ger ew pir mezin an pir piçûk be, ev tê vê wateyê ku karbidestiya amplification ya primer kêm e.

Hêjîrê 8 Encam û derketina daneyê

Pêvajoya ceribandinê:
Pêdiviyên kalîteya RNA:
Paqijî:1.72.0 destnîşan dike ku dibe ku isothiocyanate mayî hebe.Asîda nukleîk a paqij A260/A230 divê li dora 2 be. Heke di 230 nm de vegirtinek xurt hebe, ev nîşan dide ku pêkhateyên organîk ên wekî îyonên phenate hene.Digel vê yekê, ew dikare bi 1,5% elektroforez gêlê agarose were tespît kirin.Nîşanê nîşan bide, ji ber ku ssRNA xwedan denaturasyon nîne û logarîtma giraniya molekulî têkiliyek xêzikî nîne, û giraniya molekulî bi rast nayê diyar kirin.Tewandin: Teorîneji 100ng/ul kêmtir e, heke tansiyon pir kêm be, paqijî bi gelemperî kêm e ne bilind e

Fig9 RNA gel

Wekî din, heke nimûne bi qîmet be û giraniya ARNyê zêde be, tê pêşniyar kirin ku ew piştî derxistinê were aliqut kirin, û ji bo veguheztina berevajî ARN bi giraniya paşîn a 100-300ng/ul were rijandin.Lipêvajoya veguherîna berevajî, dema ku mRNA tê transkrîbkirin, primerên oligo (dt) yên ku dikarin bi taybetî bi dûvikên polyA ve girêbidin, ji bo veguheztina berevajî têne bikar anîn, dema ku lncRNA û circRNA ji bo veguheztina berevajî ya ARNyê ya tevayî primerên hexamer (Random 6 mer) bikar tînin.Gelek pargîdanî nuha kîteyên taybetî yên dûvikê dane destpêkirin.Ji bo rêbaza stem-loop, rêbaza dûvikê rehettir e, bi rêveçûna bilindtir, û reagent-teserûber e, lê bandora cudakirina miRNAyên heman malbatê divê ne bi qasî rêbaza stem-loopê baş be.Her kîteyek veguheztina berevajî hewcedariyên ji bo berhevkirina primerên gen-taybetî (stem-loops) heye.Referansa navxweyî ya ku ji bo miRNA tê bikar anîn U6 e.Di pêvajoya veguheztina stûn-loopê de, divê lûleyek U6 ji hev veqetandî were vegerandin, û pêşbirkên pêş û paşîn ên U6 rasterast werin zêdekirin.Hem circRNA û hem jî lncRNA dikarin HKG wekî referansa navxweyî bikar bînin.Litespîtkirina cDNA,
ger pirsgirêkek ARNyê tune be, cDNA jî divê baş be.Lêbelê, heke bêkêmasî ya ceribandinê were şopandin, çêtirîn e ku meriv genek referansa navxweyî (genê referansê, RG) bikar bîne ku dikare gDNA ji cds-ê veqetîne.Bi gelemperî, RG genek malê ye., HKG) wek ku di jimar 10 de tê nîşandan;Wê demê, min proteîna hilanîna soya çêdikir, û actin7 ku întron vedihewîne wekî referansa navxweyî bikar anî.Mezinahiya perçeya zêdekirî ya vê primerê di gDNA de 452 bp bû, û ger cDNA wekî şablon were bikar anîn, ew bû 142 bp.Dûv re encamên testê dît ku beşek ji cDNA bi rastî ji hêla gDNA ve hatî xera kirin, û ev jî îspat kir ku di encama veguheztina berevajî de pirsgirêk tune, û ew dikare wekî şablonek ji bo PCR were bikar anîn.Bêkêr e ku meriv rasterast bi cDNA-ê re elektroforeziya gel agarozê bimeşîne, û ew bandek belav e, ku ne qayil e.

Fig 10 Vedîtina cDNA

Diyarkirina şert û mercên qPCRBi gelemperî li gorî protokola kîtê, bi gelemperî di gava gavê nirxa tm de pirsgirêk tune.Heke di dema sêwirana primerê de hin aşîkar baş nehatine sêwirandin, di encamê de ferqek mezin di navbera nirxa tm û 60 °C ya teorîkî de çêdibe, tê pêşniyar kirin ku cDNA Piştî ku nimûne tevbigerin, PCR-ya gradient bi primers re bixebitin, û hewl bidin ku germahiyê bêyî bandên wekî nirxa TM-yê nexin.

Analîzkirina daneyan

Rêbaza pêvajoyek mîqdar a PCR ya florescence ya têkildar bi bingehîn li gorî 2 ye-ΔΔCT.Şablonên hilberandina daneyan.

Berhemên Têkildar:

Wextê rastîn PCR hêsan^TM -Teqman

Wextê rastîn PCR hêsan^TM –SYBR KESK I

RT Easy I (Master Premix ji bo senteza cDNA ya yekem)

RT Easy II (Master Premix ji bo senteza cDNA ya yekem ji bo qPCR)