Wekî nû di laboratuarê de, ne karekî baş e ku meriv nebatên erênî ji komek nebatan bi rêjeya veguheztinê ya kêm veşêre.Pêşî divê DNA yek bi yek ji hejmareke mezin ji nimûneyan were derxistin û dûv re jî genên biyanî bi PCR-ê werin tespît kirin.Lêbelê, encam bi gelemperî bi çend tiştan re carinan vala û bend in, lê ne gengaz e ku meriv diyar bike ka tespîtên wenda an tespîtên derewîn hene..Gelo rûbirûbûna pêvajo û encamên bi vî rengî yên ceribandinê pir bêçare ye?Xem neke, bira we fêrî we dike ka meriv çawa nebatên erênî yên transgenîkî bi hêsanî û rast derdixe holê.

Asta 1ê

primerên tespîtkirina sêwiranê

Gena endojen û gena biyanî ya ku li gorî nimûneya ku tê ceribandin were tesbît kirin diyar bikin, û ji bo sêwirana primerê rêzek 100-500 bp di genê de hilbijêrin.Pîmerên baş dikarin rastbûna encamên tespîtkirinê misoger bikin û dema tespîtkirinê kurt bikin (li pêvekê ji bo primerên tespîtkirinê yên ku bi gelemperî têne bikar anîn binêre).

Hişyarî: Pêdiviyên ku primerên nû hatine sêwirandin hewce ne ku şert û mercên reaksiyonê xweştir bikin û rastbûn, rastbûn û sînorê vedîtina vedîtinê berî tespîtkirina pîvana mezin verast bikin.

Gav 2

Protokola ceribandinê sêwirînin

Kontrola erênî: DNA-ya paqijkirî ya ku perçeya armancê vedihewîne wekî şablonek bikar bînin da ku diyar bikin ka pergala reaksiyona PCR û şert û mercên normal in.

Kontrola negatîf / vala: Şablonek DNA an ddH2O ya ku perçeya armancê nahewîne wekî şablon bikar bînin da ku bibînin ka di pergala PCR de çavkaniyek gemarî heye yan na.

Kontrola referansê ya hundurîn: Kombînasyona primer/lêkolînê ya gena endojen a nimûneya ku tê ceribandin bikar bînin da ku binirxînin ka şablon dikare bi PCR were tespît kirin.

Nivîsk:

Divê ji bo her ceribandinê kontrolên erênî, neyînî / vala û kontrolên kontrola hundurîn werin danîn da ku rastdariya encamên ceribandinê binirxînin.

Amadekirina ceribandinê

Berî ku bikar bînin, bala xwe bidin ka çareserî bi rengek wekhev tevlihev e.Ger barîn hat dîtin, berî karanîna pêdivî ye ku ew li gorî rêwerzan were hilweşandin û tevlihev kirin.Pêdivî ye ku 2×PCR tevlihevî berî karanîna bi mîkropîpettê were pîpet kirin û gelek caran were tevlihev kirin da ku ji belavkirina îyonê ya neyeksan dûr bikevin.

Nivîsk:

Manual derxînin û bi baldarî bixwînin, û berî ceribandinê li gorî hewcedariyên manualê amadehiyên hişk bikin.

Gav 4

Pergala reaksiyonê ya PCR amade bikin

Li gorî protokola ceribandinê, primers, H2O, û 2×PCR bi rengek wekhev tevlihev bikin, santrîfuj bikin û li her lûleya reaksiyonê belav bikin.

Nivîsk:

Ji bo ceribandinek mezin an dirêj-dirêj, tê pêşniyar kirin ku pergala reaksiyonê ya PCR-ê ya ku enzîma UNG-ê vedihewîne bikar bînin, ku dikare bi bandor ji qirêjiya aerosolê ya ku ji hêla hilberên PCR ve hatî çêkirin dûr bixe.

Gav 5

Şablonê reaksiyonê zêde bikin

Bi karanîna teknolojiya Direct PCR, ne hewce ye ku pêvajoyek paqijkirina asîda nukleîk a westayî, şablona nimûneyê di nav 10 hûrdeman de were amadekirin, û pergala reaksiyonê ya PCR-ê ya têkildar dikare were zêdekirin.

Nivîsk:

Rêbaza veqetandinê xwedan bandorek tespîtkirina çêtir e, û hilbera ku hatî wergirtin dikare ji bo reaksiyonên gelek tespîtkirinê were bikar anîn.

5.1: Berfirehkirina rasterast ya pelan

Li gorî mezinahiya wêneya di destanê de, tevna pelê bi qalibê 2-3 mm birîn û têxin nav pergala reaksiyonê ya PCR.

Nîşe: Piştrast bikin ku perçeyên pelan bi tevahî di nav çareseriya reaksiyonê ya PCR-ê de têne avêtin, û tevna pelê zêde zêde nekin.

5.2: Rêbaza parçekirina pelan

Tewra pelê bi qalindahiya 5-7 mm jê dikin û têxin lûleya santrîfujê.Heke hûn pelên gihîştî hildibijêrin, ji kerema xwe ji karanîna tevnên rehên sereke yên pelê dûr bisekinin.50ul lîzata Buffer P1 bi pîpetê bike nav lûleya santrîfûjê da ku pê ewle bibe ku lîzat dikare tevna pelê bi tevahî veşêre, wê têxin nav gerîdeyek termal an hemamek metal, û 5-10 hûrdeman li 95°C lîz bikin.

50 ul çareseriya bêbandorkirina Buffer P2 lê zêde bikin û baş tevlihev bikin.Lîzata encam dikare wekî şablonek were bikar anîn û li pergala reaksiyonê ya PCR were zêdekirin.

Nîşe: Hejmara şablonê di navbera 5-10% ya pergala PCR de ye, û divê ji% 20 derbas nebe (mînak, di pergala PCR ya 20 μl de, 1-2 μl çareseriya lîzê zêde bike, ne ji 4 μl).

Gav 6

Reaksiyona PCR

Piştî santrîfujkirina lûleya reaksiyonê ya PCR, ew ji bo zêdekirinê di nav amûrek PCR de tê danîn.

Nivîsk:

Reaksiyonê ji bo zêdekirinê şablonê nepaqijkirî bikar tîne, ji ber vê yekê hejmara çerxên zêdekirinê 5-10 çerxên ji dema karanîna şablonê ADN-ya paqijkirî zêdetir e.

Gav 7

Vedîtina elektroforez û analîza encamê

M: 100bp DNA Ladder

1\4: Rêbaza DNA ya paqijkirî

2\5: Rêbaza PCR ya rasterast

3\6: Kontrola vala

QC:

Encamên ceribandinê yên kontrolên cihêreng ên ku di ceribandinê de hatine destnîşan kirin divê şertên jêrîn bicîh bînin.Wekî din, divê sedema pirsgirêkê were analîz kirin, û piştî ku pirsgirêk ji holê rabe divê ceribandin dîsa were kirin.

Tablo 1. Encamên testa normal ên komên cûda yên kontrolê

*Dema ku plasmîd wekî kontrolek erênî tê bikar anîn, encamên testa gena endojen dikare neyînî be

Encama biryarê:

A. Encama testê ya gena endojen a nimûneyê neyînî ye, ev nîşan dide ku DNAya ku ji bo tespîtkirina PCR-ya asayî guncan e, ji nimûneyê nayê derxistin an jî ADN-ya hatî derxistin frensiyonên reaksiyona PCR-ê dihewîne û divê DNA dîsa were derxistin.

B. Encama testa gena endojen a nimûneyê erênî ye, û encama ceribandina gena exogenous neyînî ye, ku destnîşan dike ku ADN-ya minasib ji bo tespîtkirina PCR ya asayî ji nimûneyê tê derxistin, û meriv dikare were darizandin ku gena XXX di nimûneyê de nayê dîtin.

C. Encama testa gena endojen a nimûneyê erênî ye, û encama ceribandina gena eksogenous erênî ye, ku nîşan dide ku ADN-ya minasib ji bo tespîtkirina PCR ya asayî ji nimûneyê hatiye derxistin, û DNA-ya nimûneyê gena XXX heye.Ezmûnên piştrastkirinê dikarin bêtir bêne kirin.

Gav 8

primerên tespîtkirina sêwiranê

Piştî ceribandinê, 2% çareseriya hîpochlorite sodyûm û 70% çareseriya etanol bikar bînin da ku qada ceribandinê paqij bikin da ku pêşî li qirêjiya jîngehê bigirin.