Têgihiştinî
Nasnameya bilez a nebatên transgenîk
Nivîsar/Tong Yucheng
Operasyona ceribandinê / Han Ying
Edîtor / Wen Youjun
Peyv/1600+
Dema xwendinê ya pêşniyar / 8-10 hûrdem
Nasnameya bilez a nebatên transgenîk
Wekî ku di laboratûarê de nûhatî ye, ne karekî baş e ku meriv nebatên erênî ji komek nebatên bi rêjeya veguheztinê ya kêm veqetîne.Pêşî divê DNA yek bi yek ji hejmareke mezin ji nimûneyan were derxistin û dûv re jî genên biyanî bi PCR-ê werin tespît kirin.Lêbelê, encam bi gelemperî bi çend tiştan re carinan vala û bend in, lê ne gengaz e ku meriv diyar bike ka tespîtên wenda an tespîtên derewîn hene..Gelo rûbirûbûna pêvajo û encamên bi vî rengî yên ceribandinê pir bêçare ye?Xem neke, bira we fêrî we dike ka meriv çawa nebatên erênî yên transgenîkî bi hêsanî û rast derdixe holê.
Asta 1ê: primerên tespîtkirina sêwiranê
Gena endojen û gena biyanî ya ku li gorî nimûneya ku tê ceribandin were tesbît kirin diyar bikin, û ji bo sêwirana primerê rêzek 100-500 bp di genê de hilbijêrin.Pîmerên baş dikarin rastbûna encamên tespîtkirinê misoger bikin û dema tespîtkirinê kurt bikin (li pêvekê ji bo primerên tespîtkirinê yên ku bi gelemperî têne bikar anîn binêre).
Not:
Pêdivî ye ku primerên nû hatine sêwirandin şert û mercên reaksiyonê xweşbîn bikin û rastbûn, rastbûn, û sînorê vedîtina tespîtê berî ku vedîtina pîvana mezin pêk bînin verast bikin.
Gav 2:Protokola ceribandinê pêşve bibin
Kontrola erênî: DNA-ya paqijkirî ya ku perçeya armancê vedihewîne wekî şablonek bikar bînin da ku diyar bikin ka pergala reaksiyona PCR û şert û mercên normal in.
Kontrola neyînî / vala: Şablonek DNA an ddH bikar bînin2O ku perçeya armancê wekî şablonek nahewîne da ku bibîne ka di pergala PCR de çavkaniyek gemarî heye yan na.
Kontrola referansê ya hundurîn: Kombînasyona primer/lêkolînê ya gena endojen a nimûneya ku tê ceribandin bikar bînin da ku binirxînin ka şablon dikare bi PCR were tespît kirin.
Not:
Divê ji bo her ceribandinê kontrolên erênî, neyînî / vala û kontrolên kontrola hundurîn werin danîn da ku rastdariya encamên ceribandinê binirxînin.
Gav 3: Amadekirina ceribandinê
Berî ku bikar bînin, bala xwe bidin ka çareserî bi rengek wekhev tevlihev e.Ger barîn hat dîtin, berî karanîna pêdivî ye ku ew li gorî rêwerzan were hilweşandin û tevlihev kirin.Pêdivî ye ku 2×PCR tevlihevî berî karanîna bi mîkropîpettê were pîpet kirin û gelek caran were tevlihev kirin da ku ji belavkirina îyonê ya neyeksan dûr bikevin.
Not:
Talîmatan derxînin û wan bi baldarî bixwînin, û berî ceribandinê li gorî rêwerzan bi hişkî amadekariyên xwe bikin.
Gav 4: Pergala reaksiyona PCR amade bikin
Li gorî protokola ceribandinê, primers tevlihev bikin, H2O, 2×PCR tevlihev bikin, santrîfuj bikin û li her lûleya reaksiyonê belav bikin.
Not:
Ji bo ceribandinek mezin an dirêj-dirêj, tê pêşniyar kirin ku pergala reaksiyonê ya PCR-ê ya ku enzîma UNG-ê vedihewîne bikar bînin, ku dikare bi bandor ji qirêjiya aerosolê ya ku ji hêla hilberên PCR ve hatî çêkirin dûr bixe.
Gav 5: Şablona reaksiyonê zêde bikin
Bi karanîna teknolojiya Direct PCR, hewcedariya pêvajoya paqijkirina asîda nukleîk a westayî tune.Şablona nimûneyê dikare di nav 10 hûrdeman de were amadekirin û li pergala reaksiyona PCR ya têkildar were zêdekirin.
Not:
Rêbaza Lysis xwedan bandorek tespîtkirina çêtir e, û hilbera ku hatî wergirtin dikare ji bo reaksiyonên gelek tespîtkirinê were bikar anîn.
5.1: PCR rasterast ya pelan
Li gorî mezinahiya wêneya di destanê de, tevna pelê bi qalibê 2-3 mm birîn û têxin nav pergala reaksiyonê ya PCR.
Nîşe: Piştrast bikin ku perçeyên pelan bi tevahî di nav çareseriya reaksiyonê ya PCR-ê de têne avêtin, û tevna pelê zêde zêde nekin.
5.2: Rêbaza lîza pelan
Tewra pelê bi qalindahiya 5-7 mm jê dikin û têxin lûleya santrîfujê.Heke hûn pelên gihîştî hildibijêrin, ji kerema xwe ji karanîna tevnên rehên sereke yên pelê dûr bisekinin.50ul lîzata Buffer P1 bi pîpetê bike nav lûleya santrîfûjê da ku pê ewle bibe ku lîzat dikare tevna pelê bi tevahî veşêre, wê têxin nav gerîdeyek termal an hemamek metal, û 5-10 hûrdeman li 95°C lîz bikin.
50 ul çareseriya bêbandorkirina Buffer P2 lê zêde bikin û baş tevlihev bikin.Lîzata encam dikare wekî şablonek were bikar anîn û li pergala reaksiyonê ya PCR were zêdekirin.
Nîşe: Mîqdara şablonê divê di navbera 5-10% ya pergala PCR de be, û divê ji% 20 derbas nebe (mînak, di pergala PCR ya 20 μl de, 1-2 μl tampon lîzê lê zêde bike, ne ji 4 μl).
Gav 6: Reaksiyona PCR
Piştî santrîfujkirina lûleya reaksiyonê ya PCR, wan ji bo zêdekirinê di nav amûrek PCR de bi cîh bikin.
Not:
Reaksiyonê ji bo zêdekirinê şablonê nepaqijkirî bikar tîne, ji ber vê yekê hejmara çerxên zêdekirinê 5-10 çerxên ji dema karanîna şablonê ADN-ya paqijkirî zêdetir e.
Gav 7: Vedîtina elektroforez û analîza encamê
M: 100bp DNA Ladder
1\4: Rêbaza DNA ya paqijkirî
2\5: Rêbaza PCR ya rasterast
3\6: Kontrola vala
Kontrola Kalîteyê:
Encamên ceribandinê yên kontrolên cihêreng ên ku di ceribandinê de hatine destnîşan kirin divê şertên jêrîn bicîh bînin.Wekî din, divê sedema pirsgirêkê were analîz kirin, û piştî ku pirsgirêk ji holê rabe divê ceribandin dîsa were kirin.
Tablo 1. Encamên testa normal ên komên cûda yên kontrolê
*Dema ku plasmîd wekî kontrolek erênî tê bikar anîn, encamên testa gena endojen dikare neyînî be
Encama biryarê:
A. Encama testê ya gena endojen a nimûneyê neyînî ye, ev nîşan dide ku DNAya ku ji bo tespîtkirina PCR-ya asayî guncan e, ji nimûneyê nayê derxistin an jî ADN-ya hatî derxistin frensiyonên reaksiyona PCR-ê dihewîne û divê DNA dîsa were derxistin.
B. Encama testê ya gena endojen a nimûneyê erênî ye, û encama ceribandina gena exogenous neyînî ye, ku nîşan dide ku ADN-ya ku ji bo tespîtkirina PCR ya asayî ji nimûneyê tê derxistin, û dikare were darizandin ku gena XXX di nimûneyê de nayê dîtin.
C. Encama testê ya gena endojen a nimûneyê erênî ye, û encama ceribandina gena eksogenous erênî ye, ku nîşan dide ku ADN-ya ku ji bo tespîtkirina PCR ya asayî ji nimûneyê hatî derxistin, û DNA-ya nimûneyê gena XXX-ê dihewîne.Ezmûnên piştrastkirinê dikarin bêtir bêne kirin.
Gav 8: Pêşkêşên tespîtkirina sêwiranê
Piştî ceribandinê, 2% çareseriya hîpochlorite sodyûm û 70% çareseriya etanol bikar bînin da ku qada ceribandinê paqij bikin da ku pêşî li qirêjiya jîngehê bigirin.
Pêvok
Tablo 2. Pîmerên ku bi gelemperî ji bo tespîtkirina PCR-ya giştî ya nebatên genetîk guhertî têne bikar anîn
Belgeya referansê:
SN/T 1202-2010, Rêbaza tespîtkirina PCR ya Kalîteyî ji bo pêkhateyên nebatê yên genetîka guhertî yên di xwarinê de.
Daxuyaniya Wezareta Çandiniyê 1485-5-2010, Ceribandina pêkhateyên nebatên genetîk guhertî û berhemên wan-birîca M12 û jêderkên wê.
Dema şandinê: Jun-09-2021
