一、Hesasiya pergala reaksiyonê zêde bikin:

1. RNA-ya kalîteya bilind veqetînin:

Senteza cDNA ya serketî ji RNA-ya kalîteya bilind tê.Pêdivî ye ku RNA-ya kalîteya bilind bi kêmî ve bi dirêjahî be û ji înhîbîtorên transkriptase berevajî yên wekî EDTA an SDS bêpar be.Qalîteya ARN-ê mîqdara herî zêde ya agahdariya rêzikê ya ku hûn dikarin li cDNA-yê veguherînin diyar dike.Rêbazek paqijkirina RNA ya hevpar rêbazek yek-gavekî ye ku bi karanîna guanidine isothiocyanate / asîd fenolê bikar tîne.Ji bo pêşîlêgirtina gemarîbûna bi şopên RNase, RNA ya ku ji nimûneyên dewlemend ên RNase veqetandî (wek pankreas) pêdivî ye ku di formaldehyde de were hilanîn da ku RNA-ya kalîteya bilind biparêze, nemaze ji bo hilanîna demdirêj.ARNya ku ji kezeba mişkê dihat derxistin, piştî ku hefteyekê di avê de hat hilanîn, di esasê xwe de hilweşiya, ARNya ku ji kezeba mişkan hat derxistin, piştî ku 3 salan di avê de hat hilanîn stabîl ma.Wekî din, transkrîptên ku ji 4 kb dirêjtir in, ji xerabûna ji hêla RNaseyên şopî ve ji transkrîptên piçûk hesastir in.Ji bo zêdekirina aramiya nimûneyên RNA yên hilanîn, RNA dikare di formamideya deionîzekirî de were hilweşandin û di -70°C de were hilanîn.Formamide ku ji bo parastina ARNyê tê bikar anîn divê ji bermayiyên RNA-hilweşînker bêpar be.RNA ji pankreasê dikare bi kêmî ve salek di formamide de were parastin.Dema ku hûn amadekariya bikaranîna ARNyê dikin, hûn dikarin rêbaza jêrîn bikar bînin da ku ARN-ê bibarînin: NaCl bi 0,2 M û 4 qatê qebareya etanolê zêde bikin, 3-5 hûrdeman li germahiya odeyê bihêlin û 5 hûrdeman li 10,000 × g santrîfuj bikin.

2. RNaseH-neçalak (RNaseH-) transkriptaza berevajî bikar bînin:

Inhibitors RNase bi gelemperî ji bo berevajîkirina reaksiyonên transkripsiyonê têne zêdekirin da ku dirêjahî û hilberîna senteza cDNA zêde bikin.Pêdivî ye ku înhîbîtorên RNase di dema reaksiyona senteza rêza yekem de li ber hebûna tampon û ajanek kêmker (wek DTT) werin zêdekirin, ji ber ku pêvajoya beriya senteza cDNA mêtîngerê dadiqurtîne, bi vî rengî RNase ya girêdayî ku dikare RNA-yê hilweşîne, berdide.Inhibitorsên proteîn RNase tenê pêşî li hilweşandina RNA ji hêla RNase A, B, C ve digirin, û pêşî li RNase li ser çerm nagirin, ji ber vê yekê hişyar bimînin ku tevî karanîna van înhîbîtoran RNase ji tiliyên xwe dernexin.

Transkriptaza berevajî veguherîna ARN bo cDNA katalîz dike.Hem M-MLV û hem jî AMV ji bilî çalakiya xweya polîmerazê xwedan çalakiya RNaseH ya endojen in.Çalakiya RNaseH û çalakiya polîmerazê ji bo zincîra hîbrid a ku di navbera şablonê RNA û primera ADN-ê an zincîra dirêjkirina cDNA de pêk tê bi hev re pêşbaziyê dikin, û di kompleksa RNA:DNA de zincîra ARNyê hilweşînin.Şablona RNA ya ku ji hêla çalakiya RNaseH ve hatî hilweşandin êdî nikare wekî substratek bi bandor ji bo senteza cDNA-yê bixebite, ku berberî û dirêjahiya senteza cDNA kêm dike.Ji ber vê yekê, ew ê sûdmend be ku hûn çalakiya RNaseH ya transkrîptaza berevajî jêbirin an pir kêm bikin.

SuperScript Ⅱ transkrîptaza berevajî, RNaseH- MMLV transkrîptaza berevajî û thermoScript transkrîptaza berevajî, RNaseH- AMV, dikarin ji MMLV û AMV bêtir cDNA-yê bi dirêjahî û dirêjtir bistînin.Hesasiya RT-PCR dê ji hêla mîqdara senteza cDNA ve were bandor kirin.ThermoScript ji AMV pir hesastir e.Mezinahiya hilberên RT-PCR ji hêla kapasîteya transkriptaza berevajî ya ji bo sentezkirina cDNA ve tê sînorkirin, nemaze dema ku cDNA-yên mezintir klon dikin.Li gorî MMLV, SuperScripⅡ bi girîngî hilberîna hilberên dirêj ên RT-PCR zêde kir.RNaseH-reverse transkriptase di heman demê de germbûna germê zêde kiriye, ji ber vê yekê reaksiyonê dikare li germahiyên ji normal 37-42 °C bilindtir pêk were.Di bin şertên senteza pêşniyarkirî de, oligo(dT) primerê û 10 μCi [α-P]dCTP bikar bînin.Berhema giştî ya xêza yekem bi karanîna rêbaza baranê ya TCA hate hesibandin.CDNA-ya tev-dirêj bi karanîna bandên rêzkirî yên bi mezinahî ve hatî veqetandin û li ser gêlek agarose ya alkalîn hate analîz kirin.

3. Ji bo veguheztina berevajî germahiya inkubasyonê bilind bikin:

Germahiya inkubasyonê ya bilind arîkariya vekirina avahiya duyemîn a RNA dike, hilberîna reaksiyonê zêde dike.Ji bo piraniya şablonên ARNyê, înkubakirina ARN û primerên di 65°C de bê tampon an xwê, li dûv sarbûna bilez a li ser qeşayê dê piraniya strukturên duyemîn ji holê rabike û rê bide ku primers bi hev ve girêbidin.Lêbelê, hin şablon hîn jî xwedan strukturên duyemîn in, tewra piştî denaturasyona germê.Zêdekirina van şablonên dijwar dikare bi karanîna ThermoScript Reverse Transcriptase û danîna reaksiyona veguheztina berevajî li germahiyek bilindtir were kirin da ku mezinbûnê baştir bike.Germahiya zêde ya inkubasyonê jî dikare taybetmendiyê zêde bike, nemaze dema ku primerên gen-taybetî (GSP) ji bo senteza cDNA têne bikar anîn (binihêre Beşa 3).Ger GSP bikar bînin, pê ewle bin ku Tm ya primeran wekî germahiya inkubasyonê ya hêvîkirî ye.Olîgo(dT) û primerên rasthatî yên li jor 60°C bikar neynin.Pîvanên rasthatî pêdivî bi inkubasyonê li 25°C ji bo 10 deqîqeyan heye, berî ku germahîya 60°C zêde bibe.Ji bilî karanîna germahiyek veguheztina berevajî ya bilind, taybetmendî dikare bi rasterast veguheztina tevliheviya RNA/primer ji germahiya denaturasyonê ya 65°C berbi germahiya inkubasyonê ya veguheztina berevajî ve û lê zêdekirina tevliheviyek reaksiyonê 2× ya pêş-germkirî (cDNA senteza destpêkek germ) were başkirin.Ev nêzîkatî dibe alîkar ku pêşî li berhevkirina bingeha navmolekularî ya ku di germahiyên kêmtir de çêdibe.Guhestina germahiya piralî ya ku ji bo RT-PCR-ê hewce dike dikare bi karanîna gerîdokek termal were hêsan kirin.

Tth polymerase termostable wek DNA polymerase di hebûna Mg2+ û wekî ARN polymerase di hebûna Mn2+ de tevdigere.Ew dikare di germahiya herî zêde 65 ° C de germ bibe.Lêbelê, hebûna Mn2 + di dema PCR de dilsoziyê kêm dike, ku Tth polîmeraza ji bo zêdekirina rast-bilind, wek klonkirina cDNA-yê, kêmtir maqûl dike.Wekî din, Tth xwedan karbidestiya veguheztina berevajî kêm e, ku hesasiyetê kêm dike, û ji ber ku veguheztina berevajî û PCR dikare bi yek enzîmê ve were kirin, reaksiyonên kontrolê bêyî veguheztina berevajî nikare were bikar anîn da ku hilberên zêdekirina cDNA bi DNA-ya genomîk re tevlihev bikin.Berhemên amplification ji hev veqetandin.

4. Zêdekirinên ku veguheztina berevajî pêşve diçin:

Zêdekirinên di nav de glycerol û DMSO li reaksiyona senteza rêza yekem têne zêdekirin, ku dikare aramiya asîdeya nukleîk a dubendî kêm bike û avahiya duyemîn a RNA-yê veke.Heya 20% glycerol an 10% DMSO dikare bêyî bandorkirina çalakiya SuperScript II an MMLV were zêdekirin.AMV di heman demê de dikare heya 20% glycerol bêyî windakirina çalakiyê tehemûl bike.Ji bo ku hestiyariya RT-PCR di reaksiyona veguheztina berevajî ya SuperScriptⅡ de zêde bibe, 10% glycerol dikare were zêdekirin û di 45 °C de were înkub kirin.Ger 1/10 ji berhema reaksiyona veguheztina berevajî li PCR were zêdekirin, wê hingê hûrbûna glycerol di reaksiyona amplification de% 0.4 e, ku ji bo astengkirina PCR-ê ne bes e.

5. Dermankirina RNaseH:

Dermankirina reaksiyonên senteza cDNA bi RNaseH berî PCR dikare hestiyariyê zêde bike.Ji bo hin şablonan, tê fikirîn ku RNA di reaksiyona senteza cDNA de pêşî li girêdana hilberên zêdekirinê digire, di vê rewşê de dermankirina RNaseH dikare hestiyariyê zêde bike.Bi gelemperî, dermankirina RNaseH dema ku şablonên armancê cDNA-ya dirêj-dirêj zêde dike, wek mînak scherosis tuberous II-ya nizm-kopî pêdivî ye.Ji bo vê şablonê dijwar, dermankirina RNaseH sînyala ku ji hêla SuperScript II an cDNA-ya sentezkirî ya AMV ve hatî hilberandin zêde kir.Ji bo piraniya reaksiyonên RT-PCR, dermankirina RNaseH vebijarkî ye, ji ber ku qonaxa denaturasyona PCR-ê li 95°C bi gelemperî RNA di kompleksa RNA:DNA de hîdrolîz dike.

6. Başkirina Rêbaza Vedîtina RNA ya Piçûk：

RT-PCR bi taybetî dijwar e dema ku tenê mîqdarên piçûk ên RNA hene.Glîkojena ku di dema veqetandina RNA de wekî hilgirê tê zêdekirin dibe alîkar ku hilberîna nimûneyên piçûk zêde bike.Glîkojena bê-RNase dikare di heman demê de lê zêdekirina Trizol were zêdekirin.Glîkojen di avê de çareser dibe û dikare bi ARNyê re di qonaxa avî de were hilanîn da ku ji barîna paşîn re bibe alîkar.Ji bo nimûneyên kêmtir ji 50 mg tevnvîs an jî 106 şaneyên çandî, tansiyona pêşniyarkirî ya glycogen-a bê RNase 250 μg/ml e.

Zêdekirina BSA-ya acetilated li reaksiyona veguheztina berevajî ya bi karanîna SuperScript II dikare hestiyariyê zêde bike, û ji bo mîqdarên piçûk ên RNA, kêmkirina mîqdara SuperScript II û lê zêdekirina 40 yekîneyên frensa nukleazê RNaseOut dikare asta tespîtê zêde bike.Ger glycogen di pêvajoya veqetandina RNA de were bikar anîn, dîsa jî tê pêşniyar kirin ku dema ku SuperScript II ji bo reaksiyona veguheztina berevajî tê bikar anîn BSA an RNase astengker lê zêde bikin.

Ji bo taybetmendiya RT-PCR zêde bikin

1. CND Asynthesis:

Senteza cDNA-ya yekem dikare bi karanîna sê awayên cihêreng were destpêkirin, ku taybetmendiya wan bandorê li ser mîqdar û celebê cDNA-ya hatî çêkirin dike.

Rêbaza destpêkê ya rasthatî ya herî hindik ji sê rêbazan bû.Primer li seranserê transkriptê li gelek deveran diherike, cDNA-yên kurt û dirêj-qismî çêdikin.Ev rêbaz bi gelemperî ji bo bidestxistina rêzikên dawiya 5' û ji bo bidestxistina cDNA ji şablonên RNA yên bi herêmên avahiyek duyemîn an bi deverên bidawîbûnê yên ku ji hêla transkrîptaza berevajî ve nayên dubare kirin têne bikar anîn.Ji bo bidestxistina cDNA ya herî dirêj, pêdivî ye ku di her nimûneya ARNyê de rêjeya primera bi ARNyê bi awayekî empirîkî were destnîşankirin.Pîvana destpêkê ya primerên rasthatî ji 50 heta 250 ng di reaksiyonê 20 μl de bû.Ji ber ku cDNA ya ku ji ARN-ya tevayî bi karanîna prîmerên rasthatî tê sentez kirin di serî de RNA rîbozomî ye, bi gelemperî poly(A)+RNA wekî şablon tê hilbijartin.

Destpêkên oligo(dT) ji primerên rasthatî taybettir in.Ew bi dûvika polî(A) ya ku li dawiya 3'ya piraniya mRNAyên eukaryotî tê dîtin hîbrîdîze dibe.Ji ber ku poly(A)+ RNA bi qasî 1% heya 2% ji ARN-ya tevahî ye, hêjmar û tevliheviya cDNA ji ya primerên rasthatî pir kêmtir e.Ji ber taybetmendiya wê ya bilind, oligo(dT) bi gelemperî hewcedariya xweşbînkirina rêjeya RNA bi primers û hilbijartina poly(A)+ nake.Tê pêşniyar kirin ku di pergala reaksiyonê ya 20 μl de 0.5μg oligo(dT) bikar bînin.oligo (dT) 12-18 ji bo piraniya RT-PCR-ê maqûl e.Pergala ThermoScript RT-PCR oligo(dT)20 pêşkêşî dike ji ber ku aramiya wê ya germî ya çêtir ji bo germahiyên inkubasyonê yên bilindtir.

Pîmerên taybetî yên genê (GSP) ji bo gavê veguheztina berevajî primerên herî taybetî ne.GSP oligonukleotîdek antîsens e ku dikare bi taybetî bi rêzika armancê ya RNA re hîbrîdîze bibe, berevajî primerên rasthatî an oligo(dT), ku li hemî ARN-an vedihewîne.Heman qaîdeyên ku ji bo sêwirana primerên PCR têne bikar anîn ji bo sêwirana GSP-ê di reaksiyonên veguheztina berevajî de têne bikar anîn.GSP dikare bibe heman rêzika yekem a amplifikasyonê ya ku li dawiya 3'-ya herî zêde ya mRNA-yê dişewitîne, an jî GSP dikare were sêwirandin da ku li jêrî tîrêjê primera zêdekirina berevajî biteqe.Ji bo hin mijarên zêdebûyî, ji bo RT-PCR-ya serketî ji yekê zêdetir destpêkek antîsens pêdivî ye ku were sêwirandin ji ber ku avahiya duyemîn a RNA-ya armanc dibe ku pêşî li girêdana primer bigire.Tê pêşniyar kirin ku 1 pmol antîsense GSP di reaksiyona senteza 20 μl-ya yekem de were bikar anîn.

2. Ji bo veguheztina berevajî germahiya inkubasyonê bilind bikin:

Ji bo ku hûn ji berjewendiya tevahî ya taybetmendiya GSP-ê bi tevahî sûd werbigirin, divê transkrîptaza berevajî ya bi germahiya bilindtir were bikar anîn.Transkriptazên berevajî yên termostable dikarin li germahiyên bilindtir werin inkub kirin da ku hişkiya reaksiyonê zêde bikin.Mînakî, heke GSP di 55 °C de bişewite, dê taybetmendiya GSP bi tevahî neyê bikar anîn heke AMV an M-MLV ji bo veguheztina berevajî di hişkek kêm 37 °C de were bikar anîn.Lêbelê, SuperScript II û ThermoScript dikarin li 50°C an bilindtir reaksiyonê bikin, ku dê hilberên ne-taybet ên ku di germahiyên kêmtir de têne hilberandin ji holê rakin.Ji bo taybetmendiya herî zêde, tevliheviya RNA/primer dikare rasterast ji germahiya denaturasyonê ya 65 °C veguhezîne germahiya inkubasyonê ya veguheztina berevajî û li tevliheviyek reaksiyonê ya 2× ya pêş-germkirî (destpêka germ a senteza cDNA) were zêdekirin.Ev di germahiyên nizm de ji hevgirtina bingeha intermolekulî re dibe alîkar.Veguheztinên pirjimar ên germahiyê yên ku ji bo RT-PCR-ê hewce ne dikarin bi karanîna gerîdokek termal hêsan bibin.

3. Tevliheviya DNA ya genomîk kêm dike:

Zehmetiyek potansiyel a ku bi RT-PCR re rû bi rû maye gemarkirina DNA ya genomîk a di RNA de ye.Bikaranîna rêbazek îzolekirina RNA ya baş, wekî Trizol Reagent, dê mîqdara ADN-ya genomîk a ku amadekariya RNA-yê qirêj dike kêm bike.Ji bo ku ji hilberên ku ji DNA-ya genomîk têne derxistin dûr bikevin, RNA dikare bi DNase I-a asta amplifikasyonê were derman kirin da ku ADN-ya qirêj berî veguheztina berevajî were rakirin.Xwarina DNase I bi înkubakirina nimûneyan di 2.0 mM EDTA de ji bo 10 hûrdeman li 65 °C bi dawî bû.EDTA dikare îyonên magnesiumê kelate bike, pêşî li hîdrolîza RNA-ya girêdayî magnesium-ê di germahiyên bilind de bigire.

Ji bo ku cDNA-ya zêdekirî ji hilberên zêdekirina DNA-ya genomîk a qirêj veqetînin, dikarin primer werin sêwirandin ku her yek ji eksonan veqetîne.Berhemên PCR yên ku ji cDNA-yê têne wergirtin dê ji yên ku ji DNA-ya genomîk a gemarî têne peyda kirin kurttir bin.Wekî din, ceribandinek kontrolê bêyî veguheztina berevajî li ser her şablonek RNA hate kirin da ku were destnîşankirin ka perçeyek diyar ji DNA-ya genomîk an cDNA-yê hatî girtin.Hilbera PCR ya ku bêyî veguheztina berevajî tê wergirtin ji genomê tê wergirtin.