1. Zanîna bingehîn (heke hûn dixwazin beşa ceribandinê bibînin, ji kerema xwe rasterast derbasî beşa duyemîn bikin)
Wekî reaksiyonek jêhatî ya PCR-ya kevneşopî, PCR-ya rast-ê bi gelemperî di her çerxa reaksiyona zêdekirina PCR-ê de di wextê rast de bi guhertina nîşana fluorescence-ê ve guheztina mîqdara hilbera zêdekirinê dişopîne, û bi qasê şablonê destpêkê bi têkiliya di navbera nirxa ct û keviya standard de analîz dike.
Daneyên taybetî yên RT-PCR henebingehîn, sînorê floransêûnirxa Ct.
| bingehîn: | Nirxa floransê ya çerxa 3-15-an xêza bingehîn (bingehîn) e, ku ji ber xeletiya carinan pîvandinê çêdibe. |
| Berbend (Berdeng): | Vegot sînorê vedîtina floransê ku li cîhek guncav li devera mezinbûna berfire ya kevroşka mezinbûnê hatî danîn, bi gelemperî 10 qat ji veguheztina standard a xeta bingehîn. |
| Nirxa CT: | Dema ku nirxa fluoresansê di her lûleya reaksiyonê de digihîje bextê ew hejmara çerxên PCR ye. Nirxa Ct berevajî mîqdara şablonê destpêkê ye. |
Rêbazên nîşankirina gelemperî ji bo RT-PCR:
| awa | berjewendî | kêmasî | çarçoveya sepanê |
| SYBR KeskⅠ | Serîlêdana berfireh, hesas, erzan û hêsan | Pêdiviyên Primer zêde ne, meyla bandên ne-taybet in | Ew ji bo analîza mîqdar a genên cihêreng ên armanc, lêkolîna li ser vegotina genê, û lêkolîna li ser heywan û nebatên rekombînant transgenîk maqûl e. |
| TaqMan | Taybetmendiya baş û dubarebûna bilind | Bihayê bilind e û tenê ji bo armancên taybetî maqûl e. | Tespîtkirina pathogen, lêkolîna genê berxwedana narkotîkê, nirxandina bandoriya derman, teşhîsa nexweşiyên genetîkî. |
| çiraya molekulî | Taybetmendiya bilind, fluorescence, paşnavê kêm | Biha bilind e, ew tenê ji bo armancek taybetî maqûl e, sêwirana dijwar e, û bihayê bilind e. | Analîzkirina genê ya taybetî, analîza SNP |
2. Gavên ceribandinê
2.1 Di derbarê koma ceribandinê de- Divê di komê de gelek bîr hebin, û divê dubarekirinên biyolojîkî hebin.
| ① | Kontrola vala | Ji bo tespîtkirina rewşa mezinbûna hucreyê di ceribandinan de tê bikar anîn |
| ② | Kontrola negatîf siRNA (rêla siRNA ya ne-taybet) | Taybetmendiya çalakiya RNAi nîşan bidin.siRNA dibe ku bersivek stresê ya ne-taybet bi giraniya 200nM çêbike. |
| ③ | Kontrola Reagenta Veguheztinê | Zehmetiya reagenta veguheztinê ya li ser hucreyan an jî bandora li ser vegotina genê armanc jê derxe |
| ④ | siRNA li dijî genê armanc | Daxuyaniya gena armancê hilweşînin |
| ⑤ (vebijarkî) | siRNA erênî | Ji bo çareserkirina pirsgirêkên pergala ezmûnî û xebitandinê tê bikar anîn |
| ⑥ (vebijarkî) | Kontrola fluorescent siRNA | Karbidestiya veguheztina hucreyê dikare bi mîkroskopê were dîtin |
2.2 Prensîbên sêwirana pêşîn
| Mezinahiya perçeya zêdekirî | Bi tercîh li 100-150bp |
| Dirêjahiya Primer | 18-25 bp |
| naveroka GC | 30% -70%, çêtir e 45% -55% |
| Nirxa Tm | 58-60℃ |
| Dor | Dûr T/C berdewam;A/G berdewam |
| 3 rêzika dawî | Ji dewlemendên GC an AT dewlemend dûr bixin;bingeha termînalê bi tercîh G an C ye;çêtir e ku meriv ji T |
| Complementarity | Ji rêzikên temamker ên ji 3 bingehên zêdetir di hundurê primerê de an jî di navbera du primera de dûr bisekinin |
| Taybetmendî | Lêgerîna teqînê bikar bînin da ku taybetmendiya pêşînerê piştrast bikin |
①SiRNA taybetmendiya cureyan e, û rêzikên cureyên cuda dê cuda bin.
②SiRNA di toza ziwa ya cemidî de tê pakkirin, ku dikare 2-4 hefte li germahiya odeyê bi îstîqrar were hilanîn.
2.3 Amûr an reagentên ku hewce ne ku pêşî bêne amadekirin
| Primer (referansa navxweyî) | Di nav wan de du pêş û paş |
| Primer (genê armanc) | Di nav wan de du pêş û paş |
| ARN-a Si-yê armanc (3 xêz) | Bi gelemperî, pargîdanî dê 3 tîrêjan hevrêz bike, û dûv re yek ji sêyan ji hêla RT-PCR ve hilbijêrin. |
| Kit Transfection | Lipo2000 hwd. |
| Kîta Derxistina Bilez a RNA | Ji bo derxistina RNA piştî veguheztinê |
| Rapid Reverse Transcription Kit | ji bo senteza cDNA |
| PCR Kit Amplification | 2×Super SYBR Kesk qPCR Master Mix |
2.4 Di derbarê mijarên ku divê di gavên ceribandinê yên taybetî de balê bikişîne:
① pêvajoya veguheztina siRNA
1. Ji bo lêdanê, hûn dikarin plakaya 24-kanî, plakaya 12-kanî an jî plakaya 6-kanî hilbijêrin (giraniya navînî ya RNA ya ku di her kaniyek plakaya 24-kaniyê de tê pêşniyar kirin bi qasî 100-300 ng / uL ye), û dendika veguheztina çêtirîn a hucreyan heya 60% -80% an wusa ye.
2. Pêngavên veguheztinê û daxwazên taybetî bi hişkî li gorî rêwerzan in.
3. Piştî veguheztinê, ji bo tespîtkirina mRNA (RT-PCR) an tespîtkirina proteînê di nav 48-96 demjimêran de (WB) di nav 24-72 saetan de nimûne têne berhev kirin.
② pêvajoya derxistina RNA
1. Pêşîlêgirtina gemarî bi enzîmên biyanî.Ew bi giranî girtina mask û destanan bi tundî vedihewîne;bikaranîna tîrêjên pipetê yên sterilîzekirî û tubên EP;ava ku di ceribandinê de tê bikar anîn divê bê RNase be.
2. Tê pêşniyar kirin ku du caran wekî ku di kîtê derxistina bilez de tê pêşniyar kirin bikin, ku dê bi rastî paqijî û hilberînê çêtir bike.
3. Divê şilava çopê dest nede stûna ARNyê.
③ hejmartina RNA
Piştî ku RNA hate derxistin, ew dikare rasterast bi Nanodrop ve were pîvandin, û xwendina hindiktirîn dikare bi qasî 10ng/ul kêm be.
④Pêvajoya veguherîna berevajî
1. Ji ber hesasiyeta bilind a RT-qPCR, divê ji bo her nimûneyê herî kêm 3 bîrên paralel werin çêkirin da ku Ct-ya paşerojê pir cûda nebe an SD ji bo analîzên îstatîstîkî pir mezin be.
2. Necemidînin û nehêlin Miksa Master çend caran.
3. Divê her boriyek / qul bi tîpek nû were guheztin!Bi domdarî heman tîpa pipetê bikar neynin da ku nimûneyan zêde bikin!
4. Fîlma ku bi plakaya 96-ê ve girêdayî ye, piştî ku nimûneyê zêde bike, pêdivî ye ku bi plakek were şûştin.Çêtir e ku berî ku wê têxin ser makîneyê santrîfuj bikin, da ku şilava li ser dîwarê lûlê biherike xwarê û bilbilên hewayê rake.
⑤Analîzkirina kembera hevpar
| Demek mezinbûna logarîtmîkî tune | Dibe ku konseya bilind a şablonê |
| Nirxa CT tune | Pêngavên nerast ji bo tespîtkirina sînyalên fluorescentê; hilweşandina primers an sondajan - yekitiya wê dikare bi elektroforeziya PAGE ve were tespît kirin; mîqdara têrker a şablonê; xerakirina şablonan - dûrketina ji danasîna nepakiyan û cemidandin û şilbûna dubare di amadekirina nimûneyê de; |
| Ct>38 | Karbidestiya zêdekirina kêm;Hilbera PCR pir dirêj e;pêkhateyên reaksiyonê yên cihêreng têne hilweşandin |
| Kûçek amplification linear | Dibe ku sondaj ji ber çerxên cemidî-germkirinê yên dubare an jî ronîkirina demdirêj li ber ronahiyê bi qismî têk bibin. |
| Cûdahiya di kunên dubare de bi taybetî mezin e | Çareseriya reaksiyonê bi tevahî nayê helandin an jî çareseriya reaksiyonê nayê tevlihev kirin;hemama termal a amûra PCR bi maddeyên florescentê ve tê qirêj kirin |
2.5 Di derbarê analîzkirina daneyan de
Analîzkirina daneyê ya qPCR dikare li jimareya têkildar û mîqdara bêkêmasî were dabeş kirin.Mînakî, hucreyên di koma dermankirinê de digel hucreyên di koma kontrolê de,
MARNa gena X-ê çend caran diguhere, ev hejmartina nisbî ye;di hejmareke diyar a şaneyan de, mRNA ya gena X
Çend nusxe hene, ev hejmartina bêkêmasî ye.Bi gelemperî ya ku em di laboratûarê de herî zêde bikar tînin, rêbaza jimarî ya têkildar e.Fêrane,rêbaza 2-ΔΔctherî zêde di ceribandinan de tê bikar anîn, ji ber vê yekê tenê ev rêbaz dê li vir bi berfirehî were destnîşan kirin.
Rêbaza 2-ΔΔct: Encama ku tê bidestxistin ferqa derbirrîna gena armanc a di koma ceribandinê de li gorî gena armanc a di koma kontrolê de ye.Pêdivî ye ku karbidestiya zêdekirina hem genê armanc û hem jî gena referansa hundurîn nêzî% 100 be û devjêberdana têkildar divê ji 5% derbas nebe.
Rêbaza hesabkirinê wiha ye:
Koma kontrolê Δct = nirxa ct ya gena armancê di koma kontrolê de - nirxa ct ya genê referansa navxweyî di koma kontrolê de
Koma ceribandinê Δct = nirxa ct ya gena armanc di koma ceribandinê de - nirxa ct ya gena referansa navxweyî di koma ceribandinê de
ΔΔct=Δct koma ezmûnî-Grûba kontrolê Δct
Di dawiyê de, pirjimara cûdahiya di asta vegotinê de hesab bikin:
Biguherîne Fold=2-ΔΔct (girêdayî fonksiyona excel POWER e)
Berhemên têkildar:
Dema şandinê: Gulan-20-2023
