• PCR rêbazek e ku ji bo zêdekirina ADN-ê ji hejmarek piçûk a şablonê DNA tê bikar anîn.RT-PCR transkrîpsiyona berevajî bikar tîne da ku ji çavkaniyek RNA şablonek DNA-yê hilberîne ku wê hingê dikare were zêdekirin.
• PCR û RT-PCR bi gelemperî reaksiyonên xala dawîn in, dema ku qPCR û RT-qPCR di dema reaksiyona PCR de kînetîka rêjeya senteza hilberê bikar tînin da ku mîqdara şablonê heyî binirxînin.
• Rêbazên nû, wek PCR-ya dîjîtal, hejmartina bêkêmasî ya şablona DNA ya destpêkê peyda dike, di heman demê de rêbazên wekî PCR îzotermal hewcedariya alavên biha kêm dike da ku encamên pêbawer peyda bike.

Reaksiyona zincîra polîmerazê (PCR) teknolojiyek biyolojiya molekularî ya nisbeten hêsan û berfireh e ku ji bo zêdekirin û tespîtkirina rêzikên DNA û RNAyê tê bikar anîn.Li gorî rêgezên kevneşopî yên klonkirin û zêdekirina DNA, ku bi gelemperî dikare bi rojan bidome, PCR tenê çend demjimêran hewce dike.PCR pir hesas e û ji bo tespîtkirin û zêdekirina rêzikên taybetî şablonek hindik hewce dike.Rêbazên bingehîn ên PCR-ê ji tespîtkirina DNA û RNA ya hêsan bêtir pêş ketine.Li jêr, me ji bo hewcedariyên we yên lêkolînê nihêrînek li ser awayên cûda yên PCR û reagentên ku em li Enzo Life Sciences peyda dikin peyda kirine.Armanca me ew e ku alîkariya zanyaran bikin ku zû bigihîjin reagentên PCR da ku di projeya xweya lêkolîna paşîn de bikar bînin!

PCR

Ji bo PCR-ya standard, ya ku hûn hewce ne DNA polîmeraz, magnesium, nukleotîd, primers, şablona DNA ya ku were zêdekirin, û termosîklerek e.Mekanîzmaya PCR bi qasî armanca wê hêsan e: 1) ADN-ya dubendî (dsDNA) bi germê veqetandî ye, 2) primers li hev rêzikên DNA yên yekane, û 3) destpêk bi DNA polîmerazê têne dirêj kirin, di encamê de du kopiyên stûna DNA ya orîjînal.Pêvajoya denaturasyon, helandin, û dirêjbûnê li ser rêzek germahî û zemanan wekî yek çerxa zêdebûnê tê zanîn (Hêjîr. 1).

Pêdivî ye ku her gavê çerxê ji bo şablon û koma aşîkarê hatî bikar anîn xweşbîn bibe.Ev çerx bi qasî 20-40 caran tê dubare kirin, û hilbera zêdekirî dikare paşê were analîz kirin, bi gelemperî bi gêla agarose (Hêjî. 2).

Ji ber ku PCR rêbazek pir hesas e û ji bo reaksiyonên yekane cildên pir piçûk hewce ne, ji bo çend reaksiyonên amadekirina tevliheviyek sereke tê pêşniyar kirin.Pêdivî ye ku tevliheviya sereke baş were tevlihev kirin û dûv re bi hejmara reaksiyonên veqetandî were veqetandin, da ku her reaksiyonê heman mîqdara enzîm, dNTPs, û primers hebe.Gelek dabînker, wek Enzo Life Sciences, di heman demê de tevlihevên PCR-ê jî pêşkêş dikin ku jixwe ji bilî primers û şablona DNA-yê her tiştî vedihewîne.

Herêmên bi Guanîn/Sîtozîn-dewlemend (GC-dewlemend) di teknîkên PCR-ya standard de dijwariyek temsîl dikin.Rêzên bi GC-dewlemend ji rêzikên bi naveroka GC-ê kêmtir aramtir in.Digel vê yekê, rêzikên dewlemend ên GC-ê meyla dikin ku strukturên duyemîn ava bikin, wek pêlên porê.Wekî encamek, di qonaxa denaturasyonê de xêzên ducar ên dewlemend ên GC dijwar e ku bi tevahî ji hev veqetin.Ji ber vê yekê, ADN-polymerase bêyî astengî nikare zincîra nû sentez bike.Germahiya denaturasyonê ya bilindtir dikare vê yekê baştir bike, û verastkirinên berbi germahiyek pijandinê ya bilind û dema pijandinê ya kurttir dikare pêşî li girêdana netaybetî ya primerên dewlemend ên GC bigire.Reagentên din dikarin zêdekirina rêzikên GC-dewlemend zêde bikin.DMSO, glycerol, û betaine ji bo têkbirina strukturên duyemîn ên ku ji hêla danûstendinên GC ve têne çêkirin dibin alîkar û bi vî rengî veqetandina hêlên ducar hêsantir dike.

Destpêka Germ PCR

Amplification netaybet pirsgirêkek e ku dikare di dema PCR de çêbibe.Piraniya DNA polymerazên ku ji bo PCR têne bikar anîn di germahiyên li dora 68 °C heta 72 °C de çêtirîn dixebitin.Lêbelê, enzîm dikare di germahiyên kêmtir de jî çalak be, her çend bi dereceyek kêmtir be.Di germahiyên ku ji germahiya helandinê dûrtir in, primers dikarin ne-taybetî girêbidin û bibin sedema zêdekirina netaybetî, her çend reaksîyon li ser berfê were saz kirin.Ev dikare bi karanîna înhîbîtorên polîmerazê yên ku ji DNA polîmerazê vediqetin tenê gava ku germahiyek diyar be, were asteng kirin, ji ber vê yekê têgîna destpêka germ PCR.Inhîbîtor dikare antîbodyek be ku polîmerazê girêdide û di germahiya denaturasyonê ya destpêkê de (bi gelemperî 95 °C) denature dike.

Polymerase Fidelity Bilind

Dema ku polîmerazên ADN-ê bi rengek rastîn li rêzika şablonê ya orîjînal zêde dibin, di berhevkirina nukleotîdê de xeletî dikarin çêbibin.Di sepanên wekî klonkirin de nehevhevkirin dikare bibe sedema veguheztinên qutkirî, û proteînên xelet wergerandin an neçalak li jêrzemînê.Ji bo ku ji van nelihevhatinan dûr nekevin, polîmerazên bi çalakiyek "rastkirin" hatine nas kirin û di nav tevgerê de hatine bicîh kirin.Yekemîn polymeraza rastkirinê, Pfu, di sala 1991 de li Pyrococcus furiosus hate nas kirin.Ev enzîma Pfu xwedan çalakiyek exonuclease 3' û 5' e.Dema ku ADN tê zêdekirin, exonukleaz nukleotîdên nelihevkirî yên li dawiya 3'ya zincîrê radike.Dûv re nucleotide rast tê guhertin, û senteza DNA berdewam dike.Nasnameya rêzikên nukleotîdê yên nerast li ser bingeha girêdana tîrîfosfata nukleozîdê ya rast bi enzîmê re ye, li cihê ku girêdana bêkêmasî sentezê hêdî dike û rê dide veguheztina rast.Çalakiya rastkirina Pfu polymerase di rêza paşîn de li gorî Taq DNA-ya polymerase kêmtir xeletiyan dike.Di salên dawî de, enzîmên din ên rastnivîsandinê hatine nas kirin, û guheztinên enzîma Pfu ya orîjînal hatine çêkirin da ku rêjeya xeletiyê di dema zêdekirina DNA de bêtir kêm bikin.

RT-PCR

Veguheztina berevajî PCR, an RT-PCR, destûrê dide karanîna RNA wekî şablon.Pêvekek pêvek destûrê dide kifşkirin û zêdekirina RNA.ARN berevajî bi ADN-ya temamker (cDNA) tê veguheztin, bi karanîna transkriptaza berevajî.Kalîte û paqijiya şablonê RNA ji bo serkeftina RT-PCR bingehîn e.Pêngava yekem a RT-PCR senteza hîbrîdek DNA/RNA ye.Transkriptaza berevajî di heman demê de fonksiyonek RNase H jî heye, ku beşa RNA ya hîbrîdê xirab dike.Dûv re molekula ADN-ya yek-zindî bi çalakiya DNA-ya polymerase-a-girêdayî ya transkrîptaza berevajî di cDNA de tê temam kirin.Karbidestiya reaksiyona yekem-stranda dikare bandorê li pêvajoya mezinbûnê bike.Ji vir pê ve, prosedûra standard PCR ji bo zêdekirina cDNA tê bikar anîn.Ihtîmala vegerandina RNA li cDNA bi RT-PCR gelek avantajên xwe hene, û ew di serî de ji bo analîzkirina vegotina genê tê bikar anîn.ARN yek-zindî ye û pir bê îstîqrar e, ku karkirina pê re dijwar e.Ew bi gelemperî wekî gava yekem di qPCR de kar dike, ku di nimûneyek biyolojîkî de transkriptên RNA-yê hejmar dike.

qPCR û RT-qPCR

PCR-ya mîqdar (qPCR) ji bo gelek sepanan ji bo tespîtkirin, taybetmendîkirin û hejmartina asîdên nukleîk tê bikar anîn.Di RT-qPCR de, transkriptên RNA bi gelemperî bi berevajîkirina wan di cDNA-yê de pêşî têne hejmartin, wekî ku li jor hatî destnîşan kirin, û dûv re qPCR tête kirin.Mîna ku di PCR-ya standard de, ADN bi sê gavên dubarekirî tê zêdekirin: denaturasyon, annealkirin, û dirêjkirin.Lêbelê, di qPCR de, nîşankirina fluorescent dema ku PCR pêşve diçe berhevkirina daneyan gengaz dike.Vê teknîkê ji ber cûrbecûr rêbaz û kîmyayên berdest gelek feydeyên xwe hene.

Di qPCR-a-bingeha rengîn de (bi gelemperî kesk), nîşankirina fluorescent destûrê dide pîvandina molekulên DNA-ya zêdekirî bi karanîna rengê girêdana dsDNA.Di her dewrekê de, fluorescence tê pîvandin.Nîşana floransê li gorî mêjera ADN-ya dubarekirî zêde dibe.Ji ber vê yekê, ADN di "dema rast" de tê hejmartin (Wêne. 3).Dezawantajên qPCR-bingeha boyaxkirinê ev e ku di carekê de tenê armancek dikare were lêkolîn kirin û ku boyax dê bi her ds-DNA-ya ku di nimûneyê de heye ve girêbide.

Di qPCR-ya bingeha sondajê de, di her nimûneyê de gelek armanc dikarin bi hevdemî werin tesbît kirin, lê ev pêdivî bi optimîzekirin û sêwirana sondayek(s)-a-taybetî ya ku ji bilî primers tê bikar anîn hewce dike.Gelek celeb sêwiranên sondajê hene, lê celebê herî gelemperî sondajek hîdrolîzê ye, ku fluorophore û quncher vedigire.Veguheztina enerjiyê ya rezonansê ya fluorescence (FRET) dema ku sonda sax be rê li ber belavbûna fluorophore bi rêya quncherê digire.Lêbelê, di dema reaksiyona PCR de, sondaj di dema dirêjkirina primer û zêdekirina rêzika taybetî ya ku pê ve girêdayî ye hîdrolîz dibe.Veqetandina sondajê fluorophore ji quencherê vediqetîne û di floransê de zêdebûnek girêdayî zêdebûnê encam dide (Hêl. 4).Bi vî rengî, sînyala floransê ya ji reaksiyonek qPCR-ya-based sondajê bi mîqdara rêzika armanca sondajê ya ku di nimûneyê de heye re têkildar e.Ji ber ku qPCR-based sondajê ji qPCR-bingeha rengan taybettir e, ew bi gelemperî teknolojiyek e ku di vekolînên tespîtkirina qPCR-based de tê bikar anîn.

Amplification Izotermal

Teknîkên PCR yên ku li jor hatine behs kirin hewceyê amûrên biha yên thermocycling hewce dike ku ji bo gavên denaturasyon, helandin, û dirêjkirina germahiyên odeyê bi awakî rast bilind bikin û dakêşin.Hejmarek teknîk hatine pêşve xistin ku hewcedariya wan amûrên bi vî rengî nayîne û dikarin di hemamek avê ya hêsan de an jî di nav şaneyên balkêş de bêne kirin.Ji van teknîkan re bi hev re tê gotin zêdekirina îzotermîk û li ser bingeha xurtkirina berbiçav, xêzik, an kaskadê dixebitin.

Cûreya herî naskirî ya zêdekirina îzotermîk, zêdekirina îzotermîk a bi navbeynkar, an LAMP e.LAMP di germahiya 65⁰C de ji bo zêdekirina ADN an ARN-ê ya şablonê zêdekirina berbiçav bikar tîne.Dema ku LAMP tête kirin, çar û şeş primerên ku ji deverên DNA-ya armanc re temam dikin, bi DNA-polymerase re têne bikar anîn da ku DNAya nû sentez bikin.Du ji van destpêkeran rêzikên pejirandî hene ku rêzikên di prîmerên din de nas dikin û wan girêdidin, dihêlin ku avahiyek "loop" di ADN-ya ku nû hatî sentezkirin de çêbibe ku dûv re di qonaxên paşerojê de amplification de arîkariya annealkirina primerê dike.LAMP dikare bi gelek rêbazan were xuyang kirin, di nav de fluorescence, elektrophoresis gel agarose, an colorimetry.Hêsaniya dîtin û tespîtkirina hebûn an nebûna hilberê ji hêla rengînmetrî ve û nebûna alavên biha yên ku hewce ne, LAMP ji bo ceribandina SARS-CoV-2 vebijarkek maqûl kir li deverên ku ceribandina laboratûara klînîkî bi hêsanî peyda nebû, an hilanîn û veguhastina nimûneyan. ne pêkan bû, an jî di laboratûwarên ku berê xwedan alavên termosîkleta PCR nebûn.