Tê zanîn ku di dogmaya navendî de, ARN navbeynkarê veguheztinê yê di navbera îfadeya ADN û proteînê de ye.Li gorî tespîtkirina ADNyê, vedîtina ARNyê dikare bi awayekî objektîftir îfadeya genê ya di zîndeweran de nîşan bide.Ceribandinên ku bi ARNyê re têkildar in ev in: qRT-PCR, RNA-Seq, û tespîtkirina genê hevgirtinê, hwd. Li ser bingeha taybetmendiyên RNA bixwe (zengila şekirê RNA ji zengila şekirê ya ADNyê komeke hîdroksîlek azadtir heye), digel hejmareke mezin a RNases di hawîrdorê de, ARN ji ADNyê bêîstîqrartir û hêsantir e ku were hilweşandin.Çop li hundur, çopê derketin, heke kalîteya RNA ne baş be, wê hingê divê encamên ceribandinê ne têrker bin, bi taybetî wekî daneyên nerast an dubarebûna qels diyar bibin.Ji ber vê yekê, pêdivî ye ku bêtir baldarî li hilberandina RNA were girtin, û girêdana kontrolkirina kalîteyê jî girîngtir e ji bo misogerkirina rastbûn û rastbûna daneyên ceribandinê yên paşîn.

Ji bo kontrolkirina kalîteyê ya RNA, bi gelemperî rêbazên jêrîn ên ku bi gelemperî têne bikar anîn hene:

• Spectrophotometry
• elektroforez gel agarose
• Agilent Bioanalyzer
• PCR-ya mîqdar a fluorescentê ya rast
• Rêbaza boyaxa fluorescentê ya Qubit

01 Spectrophotometry

ARN xwedan bendên ducarî ye û lûtkeya vegirtinê bi dirêjahiya pêlê 260nm heye.Li gorî zagona Lambert-Beer, em dikarin ji lûtkeya vegirtinê ya di 260nm de hûrbûna ARNyê bihejmêrin.Wekî din, em dikarin paqijiya ARNyê jî li gorî rêjeya lûtkeyên 260nm, 280nm û 230nm bihejmêrin.280 nm û 230 nm bi rêzê lûtkeyên hilgirtina proteînan û molekulên piçûk in.Rêjeya A260/A280 û A260/A230 ya paqijiya RNA-ya kalîfîye divê ji 2yê mezintir be. Heke ew ji 2yê kêmtir be, ev tê wê wateyê ku di nimûneya RNAyê de proteîn an jî molekulek piçûk qirêjî heye û pêdivî ye ku ji nû ve were paqij kirin.Çavkaniyên gemariyê dê bandorê li ceribandinên jêrîn bike, wek astengkirina kargêriya zêdekirina reaksiyonên PCR, ku di encamê de encamên hejmarî yên nerast çêdibe.Paqijiya RNA li ser encamên paşîn bandorek mezin heye, ji ber vê yekê spektrofotometrî bi gelemperî di gava yekem de di ceribandinên asîdên nukleî de girêdanek kontrolkirina kalîteyê ya domdar e.

Figure 1. Spectruma vegirtinê ya ARN/DNA ya tîpîk

02 Elektroforeza gel agarose

Ji bilî paqijiyê, yekparebûna RNA jî yek ji nîşaneyên girîng e ji bo dadbarkirina kalîteya RNA.Hilweşîna ARNyê dê bibe sedema hejmareke mezin ji perçeyên kurt di nimûneyê de, ji ber vê yekê dê hejmara perçeyên ARNyê yên ku bi rengekî bi bandor werin tespît kirin û bi rêzika referansê ve werin vegirtin dê kêm bibe.Yekitiya RNA dikare bi elektroforezkirina RNA ya tevahî li ser gêlek agarose ya 1% were kontrol kirin.Ev rêbaz dikare gêlê bi xwe mîheng bike, an jî ji bo ceribandina yekparebûnê Pergala E-Gel™ ya pêş-fabrîk bikar bîne.Zêdetirî 80% ji tevahî RNA ARNya rîbozomî ye, ku piraniya wê ji 28S û 18S rRNA (di pergalên mammaliyan de) pêk tê.RNA-ya qalîteya baş dê du barên ronahiyê yên eşkere nîşan bide, ku bi rêzê, 28S û 18S barên geş in, li 5 Kb û 2 Kb, û rêje dê nêzîkê 2:1 be.Ger ew di rewşek belavbûyî de be, ev tê vê wateyê ku dibe ku nimûneya RNA hilweşiyabe, û tê pêşniyar kirin ku rêbaza ku paşê hatî destnîşan kirin bikar bînin da ku kalîteya RNA bêtir ceribandin.

Figure 2. Berawirdkirina RNA-ya têkçûyî (xala 2) û ARN ya saxlem (xala 3) li ser elektroforeziya gel agarose

03 Agilent Bioanalyzer

Ji bilî rêbaza elektroforez a gêlê agarose ku li jor hatî destnîşan kirin, ya ku dikare ji me re bibe alîkar ku yekitiya RNA bi hêsanî û zû nas bike, em dikarin biyoanalyzera Agilent jî bikar bînin da ku yekbûna RNA diyar bikin.Ew ji bo nirxandina giranî û yekparebûna RNA-yê hevokek mîkrofluîdîk, elektroforeziya kapîlar, û fluorescence bikar tîne.Bi karanîna algorîtmaya çêkirî ya ji bo analîzkirina profîla nimûneya RNA-yê, biyoanalyzerê Agilent dikare nirxek yekparebûna RNA-ya referansê, Jimareya Yekgirtî ya RNA (li vir wekî RIN tê binav kirin) hesab bike [1].Nirxa RIN çiqasî mezintir be, yekitiya ARNyê ew qas bilindtir e (1 zehf têkçûyî ye, 10 ya herî temam e).Hin ceribandinên ku RNA-yê tevlê dikin pêşniyar dikin ku RIN wekî pîvanek ji bo nirxandina kalîteyê bikar bînin.Bi girtina azmûnên rêzgirtinê yên bilind (li vir NGS tê binavkirin) wekî mînak, rêwerzên Repertuwara Xweparastinê ya Mirovan a Oncomine™, ku ji bo tespîtkirina receptorên antîjenê yên hucreya B û T di rêzikên panelê yên Thermo Fisher's Oncomine de tê bikar anîn, pêşniyar dike ku nimûneyên bi nirxên RIN ji 4-an mezintir werin pîvandin.Ji bo panelên cihêreng rêzikên pêşniyarkirî yên cihêreng hene, û bi gelemperî RINek bilindtir dikare daneyên bi bandortir bîne.

Wêneyê 3, di ceribandinên Repertuara Xweseriya Mirovan a Oncomine™ de, nimûneyên bi RIN ji 4 mezintir dikarin xwendinên bi bandortir û klona şaneyên T-yê bibînin.【2】

Lêbelê, nirxa RIN jî hin sînor hene.Her çend RIN bi kalîteya daneyên ceribandinê yên NGS re têkiliyek bilind heye, ew ji bo nimûneyên FFPE ne maqûl e.Nimûneyên FFPE ji bo demek dirêj ve bi kîmyewî hatine derman kirin, û RNA-ya hatî derxistin bi gelemperî xwedan nirxek RIN-a nisbeten kêm e.Lêbelê, ev nayê vê wateyê ku daneyên bi bandor ên ceribandinê divê nerazî bin.Ji bo ku kalîteya nimûneyên FFPE rast binirxînin, pêdivî ye ku em ji bilî RIN pîvandinan bikar bînin.Ji bilî RIN, bioanalyzer Agilent dikare nirxa DV200 jî wekî pîvanek nirxandina kalîteya RNA hesab bike.DV200 pîvanek e ku rêjeya perçeyên ji 200 bp mezintir di nimûneyek RNA de hesab dike.DV200 ji RIN çêtir nîşanek kalîteya nimûneya FFPE ye.Ji bo RNAya ku ji hêla FFPE ve hatî derxistin, bi hejmara genên ku bi bandor têne kifş kirin û cihêrengiya genan re têkiliyek pir zêde heye [3].Her çend DV200 dikare kêmasiyên di tespîtkirina kalîteyê ya FFPE de çêbike, biyoanalyzerê Agilent hîn jî nikare bi berfirehî pirsgirêkên kalîteyê yên di nimûneyên RNA de analîz bike, di nav de gelo di nimûneyan de astengker hene.Inhibitors bixwe dikarin bandorê li ser bandorkirina zêdekirina ceribandinên jêrîn bikin û mîqdara daneyên kêrhatî kêm bikin.Ji bo ku em zanibin ka di nimûneyê de astengkerek heye, em dikarin rêbaza PCR-ya mîqdar a fluorescent a rast-demê ku li dûv tê diyar kirin qebûl bikin.

04 PCR-ya mîqdar a fluorescentê ya rast

Rêbaza PCR-ya mîqdar a fluorescentê ya rast-ê ne tenê dikare înhîbîtorên di nimûneyê de tespît bike, lê di heman demê de bi rast qalîteya RNA-yê di nimûneya FFPE de jî nîşan bide.Li gorî analîzatorên biyolojîkî yên Agilent, amûrên mîqdar ên fluorescence-ê yên rast-ê di laboratîfên mezin ên biyolojîkî de ji ber sepana wan berfirehtir populertir in.Ji bo ceribandina kalîteya nimûneyên RNA, em tenê hewce ne ku ji bo genên referansa navxweyî, wek GUSB (Nimreya pisîkê Hs00939627) sondajên pêşîn bikirin an amade bikin.Bi karanîna vê koma destpêk, sondaj û standardan (ARN-ya tevahî ya berhevoka naskirî) ji bo pêkanîna ceribandinên mîqdar ên bêkêmasî, giraniya perçeya RNA ya bi bandor dikare wekî standarda nirxandinê ya kalîteya RNA (bi kurtasî Qalîteya RNA ya fonksiyonel (FRQ) were hesibandin).Di ceribandinek NGS de, me dît ku FRQ-ya nimûneyên RNA bi rêjeya daneya bi bandor re têkiliyek pir zêde heye.Ji bo hemî nimûneyên ji 0.2ng/uL FRQ mezintir, bi kêmî ve 70% ji xwendinê dikarin rêzika referansê bi bandor veşêrin (Wêne 4).

Wêneyê 4, nirxa FRQ ya ku bi rêbaza mîqdar a fluorescence ve hatî vedîtin bi daneyên bandor ên ku di ceribandina NGS de hatine bidestxistin re têkiliyek pir zêde heye (R2> 0.9).Xeta sor nirxa FRQ ya 0,2 ng/uL e (log10 = -0,7).【4】

Digel ku ji bo nimûneyên FFPE-ê tê sepandin, rêbaza PCR-ya mîqdar a rast-dem dikare di nimûneyan de înhîbîtoran jî bi bandor bişopîne.Em dikarin bi Kontrola Pozîtîv a Navxweyî (IPC) û Assaya wê re nimûneya ku were tespît kirin di pergala reaksiyonê de zêde bikin, û dûv re pîvandina fluorescenceyê bikin da ku nirxa Ct bistînin.Ger nirxa Ct di reaksiyona bê-nimûneyê de li pişt nirxa Ct bimîne, ew destnîşan dike ku înhîbîtor di nimûneyê de heye û di reaksiyonê de kargêriya zêdekirinê asteng dike.

05 Rêbaza boyaxkirina floransent Qubit

Qubit Fluorometre amûra piçûk a ku herî zêde tê bikar anîn ji bo berhevdana asîdên nukleîk û tespîtkirina paqijiyê ye, ku xebitandina wê hêsan e û hema hema di her laboratûara biyolojiya molekulî de heye.Ew bi vedîtin û boyaxkirina fluorescentê ya girêdayê asîda nukleîk (reagenta tespîtkirina Qubit) bi durustî hûrbûna asîda nukleîk hesab dike.Qubit xwedan hesasiyet û taybetmendiya bilind e, û dikare RNA-yê bi qasê pg/μL bi qasê rast bike.Ji xeynî şiyana naskirî ya ku bi qasê rast berhevoka asîda nukleîk bihejmêre, modela nû ya herî dawî ya Thermo Fisher, Qubit 4.0, dikare yekparebûna RNA jî tespît bike.Pergala vedîtina RNA ya Qubit 4.0 (RNA IQ Assay) yekbûna RNAyê bi hevdemî vedîtina du rengên fluorescentê yên taybetî tespît dike.Ev her du boyaxên fluorescent dikarin bi parçeyên mezin û perçeyên piçûk ên ARNyê ve girêbidin.Van her du rengên floransent rêjeya perçeyên mezin ên ARNyê di nimûneyê de destnîşan dikin, û ji vê yekê nirxa IQ (Tevahî û Qalîteyê) ku kalîteya RNA temsîl dike dikare were hesibandin.Nirxa IQ hem ji bo nimûneyên FFPE û hem jî ji bo nimûneyên ne-FFPE re derbasdar e, û bandorek mezin li ser kalîteya rêzkirina paşîn heye.Di ceribandinên NGS de wekî nimûne, di ceribandinên testa RNA-Seq de ku li ser platforma Ion torrent™ hatine kirin, piraniya nimûneyên bi nirxên IQ-ê ji 4-ê mezintir bi kêmî ve 50% xwendinên bi bandor hebûn (Wêne 5).Li gorî rêbazên tespîtkirina jorîn, Qubit IQ Assay ne tenê ji xebitandinê rehettir e û kêmtir wext digire (di nav pênc hûrdeman de), lê di heman demê de têkiliyek mezin di navbera pîvana pîvana pîvana IQ û kalîteya daneya ceribandinên jêrîn de jî heye.

Wêneyê 5, têkiliyek mezin di navbera nirxa Qubit RNA IQ û xwendinên nexşandî yên RNA-Seq de heye.【5】

Di nav danasîna jorîn de, ez bawer dikim ku her kes têgihiştinek têra xwe ji rêbazên cûda yên kontrolkirina kalîteya RNA heye.Di pratîkê de, hûn dikarin hilbijêrinrêbaza têkildar li gorî celebê nimûne û amûrên heyî.Tenê bi baş kontrolkirina kalîteya RNA-yê em dikarin ji têkçûna ceribandinên paşerojê yên ku ji ber qalîteya nimûneya belengaz derketine dûr bixin, bi vî rengî dem, enerjî û lêçûnek hêja xilas dikin.

Berhemên referans:

Animal Total Isolation RNA Kit

Kîta îzolekirina RNA ya tevhev

referansên

【1】 Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN: jimareyek yekparebûna RNA ji bo danasîna nirxên yekitiyê ji pîvandinên RNA re.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Oncomine Human Immune Repertuara Rêbernameya Bikarhêner (Pub. No. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Metrîkên Qalîteya Pêşkeftî yên Ji Bo Nirxkirina RNA-yê ku Ji Arşîvên Parafîn-Embedded-Embedded Nimûneyên Formalîn-Saxkirî, Tebax29, Zanistên Toksîkolojîk17, Tebax20, Zanistên Toksîkolojîk17, 57–373,https://doi.org/10.1093/toxsci/