1. Têgihîştina destpêkê

Di vê qonaxê de, pêdivî ye ku em hin têgeh û termînolojiyê fam bikin, da ku li pêşiya mezinên xwe xeletiyan nekin, wek:

Q: Cûdahiya di navbera RT-PCR, qPCR, PCR-ya rast-ê, û RT-PCR-a-time-ê de çi ye?

Bersiv: RT-PCR PCR veguherîna berevajî ye(PCR veguherîna berevajî, RT-PCR), ku guhertoyek bi berfirehî ya reaksiyona zincîra polîmerazê (PCR) tê bikar anîn.Di RT-PCR de, ristek RNA berevajî di DNA-ya temamker de tê veguheztin, ku paşê wekî şablonek ji bo zêdekirina ADN-ê ji hêla PCR ve tê bikar anîn.
Dema rast-PCR û qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) heman tişt in, her du jî PCR-ya mîqdar a rast-ê ne, ku tê vê wateyê ku her çerxa PCR-ê xwedan tomarên daneya rast-dem e, ji ber vê yekê hejmara şablonên destpêkê dikare analîzek rastîn were sererast kirin.

Her çend hem PCR-ya Real-time (PCR-ya mîqdar a fluorescentê ya rast-rast) û hem jî PCR-ya veguheztina berevajî (PCR-veguheztina berevajî) wekî RT-PCR bi kurtî xuya dikin, peymana navneteweyî ev e: RT-PCR bi taybetî bi veguheztina berevajî vedibêje.PCR, PCR-ya rast-ê bi gelemperî wekî qPCR (PCR-ya rast-a-dema hejmarî) tê kurt kirin..

Û RT-PCR-ya rast-ê (RT-qPCR), ew PCR-ya veguheztina berevajî ye ku bi teknolojiya mîqdar a fluorescent re tê hev kirin.: Pêşî cDNA (RT) ji transkrîpsîyona berevajî ya RNA bistînin, û dûv re ji bo analîza mîqdar (qPCR) Real-time PCR bikar bînin.Pir laboratuar RT-qPCR dikin, ango lêkolîna li ser kêm-rêkûpêkkirina îfadeya RNA, ji ber vê yekê qPCR ya ku her kes di laboratîfê de behs dike, bi rastî RT-qPCR vedibêje, lê ji bîr nekin ku hîna jî gelek ceribandinên DNA di sepanên klînîkî de hene.Analîza mîqdar, wek tespîtkirina HBV-ya virusa hepatît B.

Pirs: Piştî xwendina pir PCR-ya mîqdar a fluorescent, çima divê perçeya zêdekirî di nav rêza 80-300 bp de were kontrol kirin?

Bersiv: Dirêjahiya her rêzek genê cûda ye, hin çend kb ne, hin jî bi sedan bp ne, lê em tenê hewce ne ku dirêjahiya hilberê 80-300 bp be dema ku primerên sêwirandî têne çêkirin, pir kurt an jî pir dirêj ji bo tespîtkirina PCR-ya mîqdar a fluorescent ne guncan in.Parçeya hilberê pir kurt e ku meriv ji primer-dimer veqetîne.Dirêjahîya primer-dîmer bi qasî 30-40 bp ye, û dijwar e ku meriv ji 80 bp kêmtir were ferq kirin ka ew dimer-dîmer e an hilberek e.Ger perçeya hilberê pir dirêj be, ji 300 bp zêdetir be, ew ê bi hêsanî rê li ber karîgeriya zêdekirina nizm bigire û nekare mîqdara genê bi bandor tespît bike.

Mînakî, gava ku hûn di dersekê de çend kes bijmêrin, hûn tenê hewce ne ku hûn çend dev bijmêrin.Heman tişt rast e dema ku hûn genan tesbît bikin, hûn tenê hewce ne ku rêzek diyar a genê tesbît bikin da ku temsîl bikin. Hemî rêz dê bike.Ger hûn dixwazin mirovan bijmêrin, divê hûn dev û poz, guh û qedehan bijmêrin û xeletî jî hêsan e.

Ji bo berferehkirinê, di lêkolîna biyolojîkî de, gelek dozên lêkolînê ji xalek heya deverê hene, ji ber ku rêza genê ya her celebek pir dirêj e, nepêwîst e û ne gengaz e ku meriv hemî perçeyan bipîve, wek rêzgirtina bakterî 16S, ku ew e ku rêzika muhafezekar a bakteriyan pêk bîne.

Pirs: Ji bo sêwirana primer qPCR dirêjahiya çêtirîn çi ye?

Bersiv: Bi gelemperî, dirêjahiya primer bi qasî 20-24bp e, ku çêtir e.Bê guman, divê em gava sêwirana primerê bala xwe bidin nirxa TM ya primerê, ji ber ku ev bi germahiya herî baş a pîvazkirinê ve girêdayî ye.Piştî gelek ceribandinan, hate îsbat kirin ku 60 ° C nirxek TM çêtir e.Ger germahiya lêdanê pir kêm be, ew ê bi hêsanî bibe sedema zêdekirina ne-taybetî.Ger germahiya lêdanê pir zêde be, dê karbidestiya amplificationê bi nisbet kêm be, lûtkeya lûtkeya mezinbûnê dê paşê dest pê bike, û nirxa CT dê dereng bimîne.

Pirs: Rêbaza boyaxê ji rêbaza lêpirsînê çawa cûda ye?

Bersiv: Rêbaza boyaxkirinêHin boyaxên floransentê, wek SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, hwd., bi serê xwe ronahiyê dernaxin, lê piştî ku bi xêza piçûk a ADN-ya du-zindî ve girêdidin dê floransê belav bikin.Ji ber vê yekê, di destpêka reaksiyona PCR de, makîneyek nikare nîşana fluorescentê bibîne.Dema ku reaksîyon digihîje qonaxa lêdan-dirêjkirinê, zincîra ducar tê vekirin, û di bin çalakiya DNA polymerase de zincîreyek nû tê sentezkirin, û molekula floransent bi hêlîna piçûk a dsDNA ve girêdide.Her ku hejmara çerxên PCR zêde dibe, her ku diçe bêtir reng bi ADN-ya dubendî ve têne hev kirin, û sînyala fluorescentê jî bi domdarî zêde dibe.Rêbaza boyaxkirinê bi piranî di lêkolînên zanistî de tê bikar anîn.
PS: Di dema ceribandinê de baldar bin, pêdivî ye ku reng bi DNAya mirovan re were hev kirin, hay jê hebe ku ew veguhezîne kesek florescent.

Rêbaza boyaxkirinê (çep) Rêbaza lêpirsînê (rast)
PS: Di dema ceribandinê de baldar bin, pêdivî ye ku reng bi DNAya mirovan re were hev kirin, hay jê hebe ku ew veguhezîne kesek florescent.

SYBR Kesk Ⅰ bi hêlîna piçûk a DNA ve girêdide

Rêbaza lêpirsînêSondaya Taqman sondaya hîdrolîzê ya ku herî zêde tê bikar anîn e.Di dawiya 5'ya sondajê de, bi gelemperî FAM, komek fluorescent heye, û sondaj bixwe rêzek temamkerê gena armancê ye.Li dawiya 3 'komek qunçkirina fluorescent heye.Li gorî prensîba veguheztina enerjiya rezonansê ya floransê (Förster veguheztina enerjiya rezonansê, FRET), dema ku koma fluorescentê ya nûçegihan (molekula floresentê ya xêrxwaz) û koma fluoresentê ya qefilî (molekula floresentê ya qebûlker) bi heyecan dibin Gava ku spektra li hev dikeve û dûrahiya 7-ê kêm e. fluoresansa molekula qebûlker, dema ku otofluoresans qels dibe.Ji ber vê yekê, di destpêka reaksiyona PCR de, dema ku sondaj di pergalê de azad û saxlem be, koma fluorescentê ya nûçegihan dê floransê dernexîne.Dema ku dişewitîne, aşît û sond bi şablonê ve girêdidin.Di qonaxa dirêjkirinê de, polîmeraz bi domdarî zincîreyên nû çêdike.ADN polymerase xwedan çalakiya exonuclease 5'-3' ye.Dema ku bigihêje sondayê, ADN-yê polîmeraz dê sondayê ji şablonê hîdrolîz bike, koma fluorescentê ya nûçegihan ji koma fluorescentê quencher veqetîne, û sînyala fluorescentê berde.Ji ber ku di navbera sondajê û şablonê de têkiliyek yek-bi-yek heye, rêbaza sondajê ji hêla rastbûn û hesasiyeta ceribandinê ve ji rêbaza boyaxê bilindtir e.Rêbaza lêkolînê bi gelemperî di teşhîsê de tê bikar anîn.

Pirs: Hejmara bêkêmasî çi ye?Pîvana Relatîf çi ye?

Bersiv: Pîvana mutleq tê wateya hesabkirina jimareya kopiya destpêkê ya nimûneya ku ji hêla qPCR ve tê ceribandin, wek mînak çend vîrusên HBV di 1 ml xwînê de hene.Encama ku ji hêla mîqdarkirina têkildar ve hatî wergirtin guhertina mîqdara gena armancê ya di nimûneyek taybetî de li gorî nimûneyek din a referansê ye, û vegotina genê zêde-rêkûpêk an birêkûpêk e.

Pirs: Dê hêjeya derxistina RNA, karbidestiya veguheztina berevajî, û karbidestiya zêdekirinê bandorê li encamên ceribandinê bike?
Pirs: Dê hilanîna nimûneyê, reagentên derxistinê, reagentên veguheztina berevajî, û vexwarinên ronahiyê bandorê li encamên ceribandinê bikin?
Pirs: Kîjan rêbaz dikare daneyên ceribandinê rast bike?

Di derbarê van mijaran de, em ê di beşên pêşkeftî û pêşkeftî yên jêrîn de bi berfirehî vebêjin.
2. zanîna pêşketî

Di derbarê PCR-ya mîqdar a fluorescentê ya rast-dem de, divê em vê rastiyê nas bikin ku her sal bi hezaran kaxezên lêkolîna zanistî têne weşandin, ku di nav wan de teknolojiya PCR-ya mîqdar a fluorescent ne hejmareke piçûk e.

Ger standardek hevpar a pîvandina ceribandina PCR ya mîqdar a fluorescent tune be, dibe ku encam pir cûda bibin.Ji bo heman genê heman celebê, bi heman rêbazê pêvajoyê re, dê encamên tespîtkirinê jî pir cûda bibin, û ji bo kesên dereng dê heman encaman dubare bikin dê dijwar be.Tu kes nizane kîjan rast e û kîjan xelet e.

Ma ev tê vê wateyê ku PCR-ya mîqdar a fluorescent teknolojiyek xapandinê ye an teknolojiyek nebawer e?Na, ji ber ku PCR-ya mîqdar a fluorescent hesastir û rasttir e, û operasyonek xelet a piçûk dê encamên bi tevahî berevajî bide.Zindanek piçûk hezar kîlometre dûr e.Nivîskarê gotarê dibe ku gelek caran ji hêla rexnegiran ve were îşkence kirin.Di heman demê de, lêkolînerên kovarê jî dijwar e ku ji encamên ceribandinên cûda hilbijêrin.

Bi tevahî, di ceribandinên PCR-ê yên rast-ê de nebûna lihevhatinê destnîşan dike.Ji bo vê yekê, zanyarên payebilind ên di pîşesaziyê de dest bi formulekirina standardan kirin,ji beşdarvanan hewce dike ku di gotarê de hin hûrguliyên ceribandin û pêvajoyek daneyê (di nav de daneyên pêwîst) peyda bikin da ku van standardan bicîh bînin.

Çavdêr dikarin bi xwendina van hûrguliyan qalîteya ceribandinê dadbar bikin;xwendevanên paşerojê jî dikarin vê yekê bikar bînin da ku ceribandinê dubare bikin an ceribandinê baştir bikin.Dûv re encamên ceribandinê yên ku bi vî rengî hatine bidestxistin tijî agahdarî, kalîteya bilind û bikarbîne.

MIBBI (Agahiyên Kêmtirîn Ji bo Lêkolînên Biyolojîkî û Biyolojîkî -http://www.mibbi.org) çêbûn.MIBBI projeyek e ku standardên ceribandinan peyda dike.Di xwezayê de tê weşandin.Ev proje ji ceribandinên cûrbecûr yên biyolojîkî re, di nav de biyolojiya hucreyê, Microarray, qPCR ku em ê nuha nîqaş bikin, hwd., armanc dike, û dema şandina destnivîsan her celeb ceribandinê peyda dike.Divê ev agahî her dem bê dayîn.

Di projeya MIBBI de, du gotar hene ku bi PCR-ya mîqdar a fluorescent ve girêdayî ne, ne.:
·RDML (Zimanê Nîşandana Daneyên PCR-ya Rast-Demê) - rêbernameyek zimanek sazkirî û raporkirina ji bo daneyên PCR-ya mîqdar ên di dema rast de;
·MIQE (Agahdariya Kêmtirîn ji bo Weşandina Ezmûnên PCR-ya Hêjdar a Rast-Time) - agahdariya hindiktirîn ji bo weşandina gotaran di derbarê ceribandinên PCR-ya mîqdar ên rast-dem de.
Pêşîn, em li ser RDML, taybetmendiya termînolojiyê biaxivin.

Ger ji bo her tiştî pênase standard tunebe, ne mimkûn e ku nîqaş berdewam bike, ji ber vê yekê ravekirina terman di azmûnê de ew qas girîng e.
Termînolojiya ku di ezmûna PCR-ya mîqdar a fluorescent de tê bikar anîn naveroka jêrîn vedihewîne.QIAGEN ji me re kurteya çêtirîn çêkir.Yên jêrîn hemî hişk inmalî .

Kûra amplification
Kevirê amplîfîkasyonê bi kêşeya ku di dema pêvajoya PCR de hatî çêkirin, bi jimareya çerxê wekî abscissa û tundiya floransê ya rast-a-demê di dema reaksiyonê de wekî ordinate vedibêje.

Pêvekek mezinbûnê ya hêja divê xwediyê taybetmendiyên jêrîn be: Rêjeya bingehîn xêz e an hinekî kêm bûye, û meylek ber bi jor a diyar tune;nuqteya lêkvedanê ya xêzikê zelal e, û şibaka qonaxa pêşangeh bi karbidestiya zêdekirinê re têkildar e.Çi qas meznahî mezin be, ew qas jî kargêriya amplification bilindtir dibe;kembera mezinbûnê ya giştî Paralelîzm baş e, nîşan dide ku karbidestiya zêdekirina her lûleyê wekî hev e;qonaxek berbiçav a kêşeya mezinbûnê ya nimûneyên kêm-konsantre diyar e.

Bingehîn (Xeta bingehîn)
Rêzeya bingehîn asta deng a çerxa destpêkê ye, bi gelemperî di navbera çerxa 3-emîn û 15-an de tê pîvandin, ji ber ku zêdebûna nirxa floransê ya ku ji hêla hilbera zêdekirinê ve hatî çêkirin di vê heyamê de nayê dîtin.Hejmara çerxên ku ji bo hesabkirina xêza bingehîn têne bikar anîn dikare cûda be û dibe ku pêdivî be ku were kêm kirin ger mîqdarên şablonê zêde werin bikar anîn an heke asta îfadeya gena armanc zêde be.

Ji bo danîna xêza bingehîn pêdivî bi dîtina daneya fluoresenceyê ji kembera zêdekirina xêzkirinê heye.Rêjeya bingehîn bi vî rengî tête danîn ku mezinbûna çerxa zêdebûnê bi jimareyek çerxê ji jimareya jorîn a çerxa bingehîn mezintir dest pê dike.Pêdivî ye ku rêzikên bingehîn ji bo her rêzika armancê ferdî bêne danîn.Nirxên navînî yên floransê yên ku di çerxên destpêkê de têne tespît kirin pêdivî ye ku ji nirxên floransê yên ku di hilberên zêdekirî de têne derxistin bêne derxistin.Guhertoyên herî paşîn ên nermalava Real-Time PCR-ya cihêreng destûrê dide xweşbînkirina otomatîkî mîhengên bingehîn ji bo nimûneyên kesane.

Di çend çerxên pêşîn ên reaksiyona zêdekirina PCR de, sînyala fluoresenceyê pir naguhere.Nêzîkbûna xêzek rast jê re xêza bingehîn tê gotin, lê heke em ji nêz ve li çend çerxên pêşîn mêze bikin, em dibînin ku di nav xeta bingehîn de tiştê ku di wêneya jêrîn de diqewime ye.

Background Background vedibêje
nirxa netaybetî ya floransê di reaksiyonê de.Mînakî: qutkirina floransê ya bêbandor;an jî hejmareke mezin ji şablonên DNA yên dubendî ji ber karanîna SYBR Green.Parçeyên paşîn ên sînyalê bi matematîkî ji hêla algorîtmaya nermalava Real-Time PCR ve têne rakirin.

sînyala Reporter
Nîşana raporter nîşana fluorescentê ya ku ji hêla SYBR Green an vekolînên rêzikên taybetî yên bi fluorescentî ve hatî çêkirin di dema PCR-ya Real-Time de vedibêje.

Nîşana Nûçegihanê Normalkirî (RN)
RN behsa tundiya floransê ya boyaxa nûçegihanê dike ku bi tundiya floransê ya boyaxa referansa pasîf ku di her çerxê de tê pîvandin tê dabeş kirin.

Passive Reference Dye
Di hin PCR-yên Real-Time de,boyaxa fluorescent ROX wekî referansa hundurîn tê bikar anîn da ku nîşana fluorescent normal bike..Ew guheztinên ji ber pîpekirina nerast, pozîsyona baş, û guheztinên floransê li ser bingehek baş-bi-kal rast dike.

Bendavê floransê (berbihar)
li jor nirxa paşîn û bi girîngî li jêr nirxa deştê ya keviya zêdekirinê hate sererast kirin.Pêdivî ye ku ew li devera xêzikî ya kêşeya amplîfasyonê de bimîne, ku qada têketin-xêzikê ya tespîtkirina PCR-ê temsîl dike.Pêdivî ye ku di nihêrîna kêşeya têketin-zêdekirinê de bend bêne danîn da ku qonaxa têketin-xêzikê ya PCR bi hêsanî were nas kirin.Ger di PCR-ya Real-Time de gelek genên armanc hebin, divê ji bo her armancê sînor were danîn.Bi gelemperî, sînyala floransê ya 15 çerxên pêşîn ên reaksiyona PCR-ê wekî nîşana paşîn a floransansê tê bikar anîn, û sînorê floransê 10 qat ji devjêberdana standard a nîşana floransê ya 3 heya 15 çerxên pêşîn ên PCR-ê ye, û qonaxa floransansê ya PCR-ê li ser pêvekêşanê ye.Bi gelemperî, her amûrek berî bikar anînê sînorê wê yê floransê heye.

Xala Derbasbûnê (CT) an Xalê Derbasbûnê (CP)
Çêleka ku tê de kerba amplification bend derbas dike (ango, xala ku tê de tespîtkirina floransê bi girîngî zêde dibe).CT dikare perçeyek be û mîqdara şablonê destpêkê dikare were hesibandin.Nirxa CT hejmara çerxên ku dema ku sînyala fluorescentê di her lûleya reaksiyonê ya PCR de digihîje sînorê diyarkirî nîşan dide.Di navbera nirxa CT ya her şablonê û logarîtma jimareya kopiya destpêkê ya şablonê de têkiliyek rêzik heye,hejmara kopiya destpêkê bilindtir e, nirxa CT-ê piçûktir dibe, û berevajî.Kulîlkek standard dikare bi karanîna standardek bi jimareya kopiya destpêkê ya naskirî were çêkirin, ku tê de abscissa nirxa CT-ê, û ordinate logarîtma jimareya kopî ya destpêkê temsîl dike.Ji ber vê yekê, heya ku nirxa CT-ê ya nimûneya nenas tê wergirtin, jimareya kopiya destpêkê ya nimûneyê dikare ji kêşeya standard were hesibandin.

Nirxa ΔCT
Nirxa ΔCT diyar dikeferqa di navbera gena armanc û nirxa CT-a gena referansa endojen a têkildar de, wekî genek xaniyek, û ji bo normalîzekirina mîqdara şablonê tê bikar anîn:
⇒ΔCT = CT (genê armanc) - CT (genê referansa endogenous)

Nirxa ΔΔCT
Nirxa ΔΔCT cudahiya di navbera nirxa ΔΔCT ya navîn a nimûneya balkêş de (mînak, şaneyên teşwîqkirî) û navînî nirxa ΔΔCT ya nimûneyek referansê (mînak, şaneyên nestimulated) diyar dike.Ji nimûneya referansê re nimûneya kalibrasyonê jî tê gotin û hemî nimûneyên din ji bo pîvandina têkildar bi vê yekê têne normalîze kirin:
⇒ΔΔCT = ΔCT ya navîn (nimûneya berjewendiyê) - ΔCT navîn (nimûneya referansê)

Genên referansa endogenous (genên referansa endogenous)
Asta îfadeya genên referansa endogenous, wekî genên malparêz (genên malparêz), di navbera nimûneyan de cûda nabe.Berawirdkirina nirxên CT-ê ya genê referansê bi gena armanc re dihêle ku asta îfadeya gena armancê li gorî mêjera RNA an cDNA-ya têketinê were normalîze kirin (li beşa li ser nirxên ΔCT li jor binêre).

Genên referansa navxweyî rast dikinhilweşîna gengaz a RNA an hebûna înhîbîtorên enzîmê di nimûneyên RNA de, û her weha guheztinên di naveroka RNA de, kargêriya veguheztina berevajî, vegerandina asîda nukleîk, û hilgirtina nimûneyê.Ji bo hilbijartina gena referansê ya çêtirîn, me algorîtma guhert da ku bijartina wê ya referansa çêtirîn bi mîhenga ceribandinê ve girêdayî be.

Kontrola navxweyî
Rêzek kontrolê ya ku di heman reaksiyonê de wekî rêzika armancê tê zêdekirin û bi lêkolînek cûda tê lêkolîn kirin (ango, pêkanîna PCR duplex).Kontrolên hundurîn bi gelemperî têne bikar anîn da ku zêdekirinên têkçûyî ji holê rakin, wek mînak dema ku rêzika armanc nayê dîtin.
Sample Calibration
Nimûneyek referansê (mînakî, RNA ya paqijkirî ji xêzek şaneyek an tevnek) ku di mîqdarkirina têkildar de tê bikar anîn da ku hemî nimûneyên din bide ber hev da ku asta vegotina têkildar a genê diyar bike.Nimûneya kalibrasyonê dikare her nimûne be, lê bi gelemperî kontrolek e (mînakek nimûneyek nehatî derman kirin an nimûneyek ji dema sifirê ya ceribandinê).

Kontrolên erênî
reaksiyonên kontrolê bi kar bîninmîqdarên naskirî yên şablonê.Kontrolên erênî bi gelemperî têne bikar anîn da ku were kontrol kirin ka komek arîmer an koma primer-sondê bi rêkûpêk dixebite û reaksiyonê rast hatî saz kirin.

Kontrola Şablon tune (NTC)
Reaksiyonek kontrolê ya ku ji bilî şablonê, ku bi gelemperî bi avê tê guheztin, hemî hêmanên pêwîst ên reaksiyona zêdekirinê vedihewîne.Bikaranîna NTC-ê dikare qirêjiya ku ji ber qirêjiya reagentê an DNA-ya biyanî ve hatî peyda kirin, bi vî rengî rast û pêbaweriya daneyên tespîtê misoger dike.Zêdekirina kontrola NTC-ê qirêjiyê nîşan dide.

Kontrola RT tune (NRT)
Pêvajoya derxistina RNA-yê dibe ku ADNya genomîkî ya mayî hebe, ku zehf zirardar e û sûcdar e ku bandorê li kalîteya daneyê û dijminê xwezayî yê qPCR dike, ji ber vê yekê dema ku ceribandinan sêwirînin, divê ew were sêwirandin ku tenê tespîtkirina RNA-yê zêde bike.Du rê hene, yek ev e ku meriv li ser întronên pêşîn sêwiran bike, ya din ew e ku DNA bi tevahî were rakirin, kîjan çêtir e, ku dê paşê were nîqaş kirin.Kontrola NTR neynikek efsûnî ye ku qirêjiya DNA-yê tespît dike.Ger zêdebûn hebe, ev tê wê wateyê ku qirêjî heye.

Standards
Standard nimûneyên berhevdana naskirî an jimara kopîyê ne ku ji bo avakirina kelek standard têne bikar anîn.Ji bo ku îstîqrara standardê were misoger kirin, perçeya genê bi gelemperî di plasmîdê de tê klon kirin û wekî standard tê bikar anîn.

Kûreya standard
bi gelemperî li gorî rêjeya duqatkirinê bi kêmî ve 5 pileyên giraniyê bi hilbera standard re tê rijandin, û 5 xal di koordînatên nirxa CT û hejmara kopiyê de têne kişandin, û xal têne girêdan da ku xetek çêbikin da ku kelek standard çêbike.Ji bo her kelek standard, pêdivî ye ku rastdariya wê were kontrol kirin.Nirxa zirav di navbera -3.3 û -3.8 de dikeve, û her konsantre sê caran tê kirin.Xalên ku bi girîngî ji xalên din cuda ne, divê werin avêtin.Nirxa CT-ê ya nimûneya ku tê ceribandin tête nav kêşeya standard, û asta vegotina nimûneya ku were ceribandin dikare were hesibandin.

Nirxa CT-ê ya nimûneya ku tê ceribandin tê gihandin keviya standard, û hejmara kopiya destpêkê ya nimûneya ku were ceribandin dikare were hesibandin.

Efficiency û Slope
Kêliya kêşeya standard karbidestiya PCR-ya rast-ê destnîşan dike.
·Xwezek ji -3.322 nîşan dide ku karbidestiya zêdekirina PCR-ê 1, an jî 100% bikêrhatî ye, û mîqdara hilbera PCR di her çerxê de ducar dibe.
·Xwezek kêmtir ji -3.322 (mînak, -3.8) kargêriya PCR nîşan dide
·Xwezek ji –3.322 mezintir (mînak, –3.0) nîşan dide ku karbidestiya PCR ji %100 mezintir xuya dike, ev yek meraq e, çawa dikare yek çerxa PCR-ê ji du qatan zêdetir berhema zêdebûyî çêbike?Ev rewş di qonaxa ne-xêzikî ya reaksiyona PCR de pêk tê, ango hejmareke mezin a amplifikasyona ne-taybetî heye.

keleka helandinê
Piştî ku zêdekirina qPCR qediya, hilbera PCR tê germ kirin.Her ku germahî zêde dibe, hilbera amplifikasyonê ya dubendî hêdî hêdî dihele, û dibe sedema kêmbûna tundiya floransê.Dema ku germek diyarkirî (Tm) bigihîje, dê hejmareke mezin a hilberan bihelînin.Fluorescence bi tundî dadikeve.Berhemên PCR yên cihêreng xwedî nirxên Tm û germahiyên helandinê yên cihê ne, ji ber vê yekê taybetmendiya PCR dikare were nas kirin.

Xalê helandinê (kevirê jêderk)
Kevirê helandinê ji bo avakirina nexşeyek lûtkeyê tête çêkirin, ku dikare bêtir bi întuatîf rewşa perçeyên hilberê PCR nîşan bide.Ji ber ku germahiya helandinê nirxa Tm ya perçeya DNA ye, hin parametreyên ku bandorê li nirxa Tm ya perçeya ADNyê dikin dikarin werin darizandin, wek mezinahiya perçeyê, naveroka GC, hwd.dirêjahiya hilbera zêdekirî di navbera 80-300 bp de ye, ji ber vê yekê germahiya helandinê divê di navbera 80 °C û 90 °C de be.

Şîrovekirina kêşeya helandinê: Ger tenê lûtkeya sereke di navbera 80°C-90°C de xuya bibe, ev tê wê wateyê ku PCR-ya mîqdar a fluorescent bêkêmasî ye;heke lûtkeya sereke di navbera 80°C-90°C de xuya bibe û lûtkeyên cûrbecûr di binê 80°C de xuya bibin, di bingeh de dimera pêşîn tê hesibandin.Hûn dikarin hewl bidin ku germahiya annealkirinê zêde bikin da ku wê çareser bikin;heke lûtkeya sereke di navbera 80°C-90°C de xuya bibe, û lûtkeya cûrbecûr dîsa xuya bibe dema ku germahî zêde dibe, di bingeh de tê hesibandin ku tevliheviya DNA heye, û pêdivî ye ku DNA di qonaxa destpêkê ya ceribandinê de were rakirin.

Helbet dîsa jî hin rewşên nenormal hene, ku dê li jêr yek bi yek werin dabeşkirin.
3. zanîna pêşketî

Ji bo ku qPCR bikim, divê ez bibêjim MIQE,Agahiyên hindiktirînji bo WeşanaHêjmarReal-Time PCRCeribandin - agahdariya herî kêm ji bo weşandina gotaran di derbarê PCR-ya mîqdar a rast-dem deceribandinên .Ji bo ku têgihîştina her kesî hêsan bikin, em ê naveroka sereke hêsan bikin.

Hûn dikarin nivîsa orîjînal a MIQE li ser Înternetê bigerin, û ya herî girîng ev e ku ew destnîşan dikelîsteya kontrolê ya daneyê ya ku divê dema ku gotarek diweşîne were peyda kirin .

Çavdêr dikarin bi xwendina van hûrguliyan qalîteya ceribandinê dadbar bikin;xwendevanên pêşerojê jî dikarin vê yekê bikar bînin da ku ceribandinê dubare bikin an baştir bikin.
Hêjayî gotinê ye ku di vê lîsteyê de, girîngiya her lîsteyê bi rêzê bi E an jî D hatiye nîşankirin.Poldayî?E: agahdariya bingehîn (divê were şandin);D: agahdariya xwestî (bi qasî ku gengaz peyda bike).

MIQE (1) - Sêwirana Ezmûnî
Gelek zozanên ku piştî qedandina xwendina xwe ya mezûniyetê berevaniya xwe qedandin dê zanibin ka meriv çawa ezmûnek serbixwe dizayn bikin, defterên xwe vekin û tiştê ku mamoste ji wan re dibêje bikin.Di encamê de, sêwirana ceribandinê ne hişk bû, û beşa redaksiyona kovarê got ku wan dixwest vî wêneyî û wî wêneyî çêkin, ji ber vê yekê wan ew bi şaşîtî kir.Kevir bi vî rengî têne çêkirin!

Nêzîkî malê, prensîba yekem a ceribandinê destnîşankirina ehişkbûna mantiqa ceribandinê.Tişta herî bingehîn sêwirana ceribandinê ye, û tiştê herî girîng di derbarê sêwirana ceribandinê de ew e ku meriv çawa nimûneya armanc, nimûneya referansê (kontrol) û hejmara dubareyan saz bike, da ku daneyên ceribandinê bêne referans kirin, berhevkirin û qanîkirin.

Nimûneya armancêvedibêje nimûneya ku ji me re hewce dike ku genê armanc piştî dermankirinek diyarkirî tespît bikin.Nimûneya referansênimûneya bê dermankirin e, ku pir caran di biyolojiyê de wekî celebê çolê tê binav kirin.

Replicates Experimentalpir girîng in.Bi gelemperî, hejmara dubareyên razber divê ji sêyan zêdetir be.Pêdivî ye ku meriv ji hev veqetîne ka çi dubarekirina biyolojîkî û çi berevajîkirina teknîkî ye.

Replicates Biyolojîk: Heman azmûna verastkirinê bi materyalên cihêreng (dem, nebat, kom, lewheyên reaksiyonê) hatî çêkirin.

Dubarekirina biyolojîk
Werin em dermankirina bîbera bi kêzikan wekî mînak bigirin.Em dixwazin li ser sê nebatên ABC-ê derman birijînin, wê hingê sê nebatên ABC sê dubareyên biyolojîkî ne, û ew heman ceribandina verastkirinê ne ku bi materyalên cûda têne kirin.Lê wekî ceribandinek, bê guman kontrolek hewce ye, ji ber vê yekê em dikarin yek ji şaxên nebatê A birijînin da ku komek ezmûnî ya nebatê A ava bikin, û şaxên din ên nebatê A nerijînin da ku komek kontrolê pêk bînin.Ji bo B û C jî heman tiştî bikin.

Replicates Teknîkî (Teknîkî Replicates): Ew ceribandinek dubare ye ku ji bo nehiştina xeletiyên ku ji ber operasyonê têne çêkirin, hatî çêkirin, ku bi rastî qulikek dubare ye ku di heman materyalê de tê de ye.Pêdivî ye ku hem dermankirin û hem jî kontrol xwedî mîhengên dubare (kêmtirîn sê) genê armanc û gena referansa navxweyî bin.

Dubarekirina teknîkî
Dîsa îsota ku bi dermanên dermankirî tê dermankirin wek mînak bigirin.Ji bo koma ceribandinê ya nebatê A, me sê kunên PCR yên 1, 2, û 3 ji bo gena wê ya armanc û gena referansa hundurîn çêkir, da ku piştî tespîtê navînî bistînin.Ji bo kontrolkirina nebat A Kom jî bi heman rengî têne derman kirin.Bi heman rengî, heman dermankirinê ji bo nebatên B û C jî bikin.Ev dubarekirina teknîkî ye.

Hêjayî gotinê ye kuya ku dikeve statîstîkê dubarekirina biyolojîkî ye, û dûbarekirina teknîkî ew e ku biceribîne gelo di prosesa ceribandinê de diyardeyên bêserûber hene yan na, da ku encamên ceribandinê pêbawer bibin, ango ji xeletiyan dûr bixin bi navgîniya wan wekî ku em pir caran dibêjin.

Kontrolên Negatîf-NTC û NRT
NTC (Kontrola Bê Şablon), kontrolek bê şablon, tê bikar anîn da ku verast bike ka materyalê ceribandinê qirêj e.Bi gelemperî, av wekî şablon tê bikar anîn.Ger reaksiyonek fluorescent hebe, ew nîşan dide ku di laboratîfê de gemarîbûna asîda nukleîk pêk hatiye.

Van gemarî ji: ava nepaqij, reagentên bêkalîte yên ku DNAya endojen dihewîne, qirêjiya primer, qirêjiya alavên laboratîfê, qirêjiya aerosolê, hwd., pêdivî ye ku mêşên RNase û astengkerên RNase bikar bînin.Herî dijwar dîtina qirêjiya aerosolê ye.Bifikirin ku laboratuvara we mîna dûmanê ye, bi cûrbecûr asîdên nukleîk ên li hewayê sekinîne.

NRT (Transkriptaza Bê Berevajî), kontrola bêyî veguheztina berevajî, ARNya ne-berepaş transkrîbekirî ye wekî kontrolek neyînî, ku kontrola bermayiya gDNA ye.

Dema ku vegotina genê tê kirin, mîqdara RNA bi tespîtkirina mîqdara cDNA piştî veguheztina berevajî tê tespît kirin.Ger dema ku RNA tê paqijkirin bermayiya gDNA hebe, ew ê di encamên ceribandinê de bibe sedema xeletiyan, ji ber ku encamên rastîn ên ku hatine bidestxistin gDNA û cDNA ne.Di asta berhevokê de, ne tenê cDNA, gDNA hewce ye ku di dema derxistina RNA de bi tevahî were rakirin.

MIQE (2) - agahdariya nimûne
Agahdariya bi navê nimûne tê vê wateyê ku dema ku em gotarek di derbarê qPCR de diweşînin, divê em agahdariya nimûneyê bi zelalî rave bikin, ku ev yek beşek domdar a gotarê ye.Bi heman rengî, dema ku em nimûneyan pêvajo dikin, divê em karûbarên xwe jî birêkûpêk bikin da ku rastdariya nimûneyan misoger bikin.

Danasîna nimûneyê tenê encamek e, û divê em bêtir bala xwe bidin materyalên ku di tevahiya ceribandinê de hatine girtin.

Hilbijartina materyalên ceribandinê
Nimûneyên xwînê - xwîna nû hilbijêrin, ji 4 saetan bêtir.Nimûneyên hucreyê - hilbijêrin ku di heyamek mezinbûna bi hêz de şaneyên nû kom bikin.Tîma Heywanê - Teşeya nû, ku bi hêz mezin dibe hilbijêrin.Tissue Plant - Teze, tevna ciwan hilbijêrin.

Divê we bala xwe dayê ku di van çend hevokan de peyveke sereke heye: taze.
Ji bo nimûneyên jorîn, kîta herî baş, biha û bi îstîqrar li sûkê kîta Foregene ye, ku dikare zû û bi hêsanî DNA û RNAya wan derxe.

Kita Mini DNA ya xwînê

Kîta îzolekirina RNA ya tevhev

Animal Total Isolation RNA Kit

Plant Total RNA Îsolation Kit

Plant Total RNA Isolation Kit Plus

Kit îzolekirina DNA ya nebatê

Depokirina materyalên ceribandinê
Bi gelemperî, heke şert û merc destûr bidin, em hilgirtina nimûneyan pêşniyar nakin.Lêbelê, gelek heval hene ku nekarin tavilê piştî ceribandinê ceribandinan bikin, û hin jî hewce ne ku tankên nîtrojena şil bixin zeviyê ji bo nimûneyê.

Ji bo hevalek bi vî rengî ya kedkar, ez tenê dikarim bibêjim ku hûn ji madeyên reagentê fam nakin.Naha gelek pargîdaniyên vexwarinê yên reagentê reagentan hilberînin ku dikarin nimûneyên RNA li germahiya odeyê hilînin, û hûn dikarin hilbijêrin ku wan bikar bînin.Rêbaza hilanîna konvansiyonel hilanîna nîtrojena şil e, bi karanîna tankek nîtrojena şil a piçûk ku hilgirtina wê hêsan e.Piştî ku nimûneyê vegerînin laboratûwarê, wê di sarincokê de -80°C biparêzin.

Ji bo ceribandinên ku bi RNA-yê ve girêdayî ne, pêdivî ye ku prensîba şeş-peyvan were şopandin:germahiya kêm, bê enzîm,ûzû .

Têgeha germahiya nizm têgihîştina hêsan e;bêyî enzîman, RNase li her derê cîhana ku em lê dijîn heye (nexwe hûn ê ji hêla HIV ve bihatana kuştin), ji ber vê yekê meriv çawa ji RNase gava ceribandinan dûr dixe têgehek pir girîng e;zû,Li dinyayê Kung Fu tune ye ku neyê şikandin, tenê leza ku nayê şikandin.

Ji ber vê yekê, di wateyekê de, dema derxistinê çi qas kurtir be, kît jî çêtir e.Çima dikeForegene's kit lezê zêde dike, ji ber ku ew baş dizanin.

PS: Hin keç gelek bi baldarî ceribandinan dikin, lê ew ne bi qasî slam dunk piştî çend salan kar in.Ew difikirin ku Xwedê neheq e, ji yên din gilî dikin û li jiyanê digerin.Bi rastî, wê ew fêm nekir.Wî ARN baş neparast, û lîstikvanê slam dunk jî gêj bû.Dema ku wî azmûn dikir, difikirî ku ew ê slam dunk bi sê caran, pênc caran û du dabeşan biqedîne, lê wî ceribandinek baş kir.

Not: Hêdîtir, bêtir şansên dagirkirina RNase.Meriv çawa xwe perwerde dike ku bilez be?Rê tune, tenê bêtir pratîk bikin.

Ji bo ceribandinên cihêreng û nimûneyên cihêreng, hîn jî pêdivî ye ku meriv bêtir wêjeyê bixwîne û ji bo pêvajoyê rêbazek guncan hilbijêrin.Ji bo pêvajoya berhevkirin û hilanînê ya nimûneyê, MIQE hewce dike ku ew bi zelalî di kaxezê de were nivîsandin, da ku vekoler karibin pêbaweriya kaxezê binirxînin, û ji bo ciwanên matmayî jî hêsan e ku ceribandina we dubare bikin.

Her çend ceribandinên biyolojîkî dijwar in, ew asta bilind in.Ger hûn hişyar nebin, hûn dikarin cîhanê hilweşînin.Mînakî, SARS bikin krîzek biyokîmyayî, an çêkirina birincê hîbrîd ku 1.3 mîlyar mirov xilas bike.Wêneyê li jêr ceribandinek kîmyewî ye, divê hûn fêm bikin ka hûn bi lêkolîna xwe çiqas serbilind in tenê bi lênihêrîna xuyangê wî ya mîna dîk.Ji bîr bike, wî reş neke.

MIQE (3) - derxistina asîda nukleîk.
Derxistina asîda nukleîk bûyerek mezin e, û hemî ceribandinên biyolojiya molekulî bi derxistina asîda nukleîk dest pê dikin.Berî her tiştî, em naveroka MIQE li ser derxistina asîda nukleîk kopî bikin.

Li vê formê dinêrin, hûn nikarin li ser rûyê erdê bimînin.Forma dogmayê ye.Ji bo ku hûn bibin xwendekarek top, divê hûn bipirsin çima.Naveroka bingehîn a vê tabloyê ev e: Bişopîninpaqijî, yekitî, hevgirtî, û mîqdara derxistina RNA .

Beşa yekem yapêvajo an amûr qonaxa derxistina asîda nukleîk e.Heke hûn ji bo derxistina asîda nukleîk a otomatîk bikar tînin (pêşketî, ji kerema xwe ji bo kirînê bi min re têkilî daynin), hûn hewce ne ku navê modela amûrê destnîşan bikin.

Navê kit û

ka kîjan kît ji bo hûrguliyên guheztinê hatine bikar anîn, çi reagentên taybetî hatine zêdekirin an çi operasyonên taybetî hatine kirin divê bi zelalî were rave kirin da ku yên din bi hêsanî ceribandina we dubare bikin.

Hin kes dema ku nimûneyên taybetî derdixin hin reagentên taybetî lê zêde dikin, difikirin ku ev çeka wan a veşartî ye û ji yên din re nabêjin.Dema ku wê veşartî dihêlin, ew di heman demê de fersendê jî winda dikin ku gotara we ronî bike.Aqilmend nebin, divê hûn di lêkolîna zanistî de ji welatê kalê Zhang durusttir bin, ger hûn bixwazin jîr bin, dê gotar we bêaqil bike.

divê hejmara hilberê ya kîtê bi bîr bînegava ku hûn kîtê ferman dikin û gotarê dinivîsin.Bi gelemperî du hejmar li ser kîtê hene: Cat-hejmara katalogê (hejmara hilberê, jimareya gotarê), Pir-hejmara pira hilberê ( Ji bo nîşan bide ku hilber ji kîjan komê hatî tê bikar anîn).

Wekî din, hejmara CAS bi gelemperî dema ku reagentên biyokîmyayî ferman dide tê bikar anîn, û ez ê wê bi hev re populer bikim.Hejmara CAS ew hejmar e ku ji hêla Civaka Kîmyewî ya Amerîkî ve ji her dermanê kîmyewî yê nû re tê dayîn.Bi gelemperî, sê jimar bi daçek ve girêdayî ne.Hejmara CAS ya Rushui: 7732-18-5.Kîmyewî bi gelemperî gelek navên xwe hene, lê hejmara CAS yekta ye.Dema ku hûn derman ferman dikin, hûn dikarin pêşî jimara wê ya CAS-ê kontrol bikin.

Nêzîkî malê, çima divê em van tiştan bi zelalî vebêjin?Bi rastî, ew e ku meriv kalîteya derxistina RNA jî kontrol bike.Bikaranîna alav û kîtan dê derxistina ARNyê hevgirtîtir bike.Pîvana derxistina laboratîfên asayî ne mezin e, û ew dikare bi kîtan were bidestxistin.

Hûrguliyên dermankirina DNase an RNase
Pirsgirêka girîng a PCR-ya mîqdar a fluorescent ew e ku pêşî li gemarîbûna DNA bigire, û ger gemarî hebe ceribandinê nekin.Ji ber vê yekê, pêdivî ye ku meriv pêvajoya ku we ji bo hilberandina DNA bikar aniye diyar bike, da ku nîşan bide ku DNA di pêvajoya ceribandinê de bi tevahî û bi tevahî ji holê rabûye.bi diyagrameke şematîk tê nîşandan.

Skematîka ARN û ADNyê
Bi gelemperî, rêbaza rakirina ADN-ê ew e ku piştî derxistina RNA bi DNase re were derman kirin.Lêbelê, ev rêbazên nisbeten kevn in.Kîtên derxistina RNA yên bazirganî karîbûn di pêvajoya derxistinê de bêyî ku DNase lê zêde bikin ADNyê jê bikin.Mînakî, rêzek kîtan ji Foregene.

Not: Rakirina ADNyê di dema derxistina ARNyê de şûrekî dudevî pir xeternak e, ku dê dema xebata derxistina ARNyê dirêj bike û xetera hilweşîna ARNyê zêde bike.Di bingeh de, ew danûstandinek di navbera hilberîna RNA û paqijiyê de ye.

Wekî din, mîqdara DNase ya ku li stûna adsorption-based silica hatî zêdekirin pir hindik e, û ji bo bidestxistina bandorê divê DNase-ya kalîteyê were bikar anîn.DNase-a neoptîmîzekirî zû û bi tevahî nayê xwar.Ev ceribandinek asta teknîkî ya bazirgan e.Bê guman, bazirganên ecêbtir jî hene ku pesnê xwe didin ku DNA bêyî DNase dikare were rakirin.Dikare were gotin ku her kesê ku pesnê xwe dide ku DNA bêyî DNase dikare bi tevahî were rakirin holîgan e.ADN avahiyek dubendî ya bi îstîqrar e, û ew tenê bi axaftin û kenê nayê ji holê rakirin.

Nirxandina pîsbûnê
rêbaza nirxandinê: tespîtkirina elektroforez, 1% agarose, 6V/cm, 15min, barkirin 1-3 ul

Analîzên mîqdar ên asîda nukleîk
Bi gelemperî bi karanîna spektrofotometerek UV tê pîvandin.Bila ez pêşî wateya sê nirxên OD260, OD280, û OD230 populer bikim.
· OD260nm: Ew dirêjahiya pêla vegirtinê ya lûtkeya hilgirtina herî bilind a asîda nukleîk e, û nirxa herî baş a pîvandinê ji 0.1 heta 1.0 diguhere.Heke na, nimûneyê hûr bikin an hûr bikin da ku wê di nav rêzê de bigirin.
·OD280nm: Ew dirêjahiya pêla vegirtinê ya lûtkeya herî bilind a hilgirtina proteîn û madeyên fenolî ye.
·OD230nm: Ew dirêjahiya pêla vegirtinê ya lûtkeya hilgirtina herî bilind a karbohîdartan e.

Piştre, em li ser rola her nîşanek biaxivin.Ji bo A260, ew dikare were bikar anîn da ku hilberîna asîda nukleîk bipîve.Dema OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

Ji bo paqijiyê, divê em li rêjeyên ku em bi gelemperî dibînin binêrin: OD260/280 û OD260/230.
·ADN-ya pak: OD260/280 bi qasî 1,8 e.Dema ku ew ji 1.9 mezintir be, ew nîşan dide ku qirêjiya RNA heye, û dema ku ew ji 1.6 kêmtir be, ew nîşan dide ku qirêjiya proteîn û fenolê heye.
·ARN ya pak: 1.7
·OD260/230: ADN be yan RNA be, nirxa referansê 2,5 e.Dema ku ew ji 2.0 kêmtir be, ew nîşan dide ku qirêjiya şekir, xwê û maddeya organîk heye.

yekbûna RNA

Pir girîng e ku meriv yekbûna RNA were pîvandin.Bi gelemperî, pêdivî ye ku meriv ceribandinek gêlê denaturasyona RNA were kirin da ku were kontrol kirin ka ronahiya di navbera 28S û 18S RNA de têkiliyek du-qatî ye.Dema bendika sêyem 5S xuya dibe, ev tê wê maneyê ku ARN dest bi rizandinê kiriye, ji xeynî bêvertebrîtan.

Daneyên ji bo nirxandina kalîteya RNA: Ji bilî ceribandinên jorîn, di heman demê de di warê yekbûna RNA de hin ceribandinên amûrê yên pêşkeftî jî hene, wek mînak ceribandina yekparebûna RQI ya pergala elektroforeziya otomatîkî ya Experion, ku dikare tespît bike ka RNA bi nedîtî tê hilweşandin.

Di lêkolîna zanistî de, PCR-ya mîqdar a fluorescent berhevokek di navbera gena armanc û gena referansa navxweyî de ye.Ji ber vê yekê, di pêvajoya parastina nimûneya RNA de, derxistina RNA, û hwd. de, armanca bingehîn ew e ku yekparçebûna RNA were misoger kirin.

Çawa yekbûna RNA bandorê li hevsengiya di navbera gena armanc û gena referansa navxweyî de dike, dikare ji jimareya jêrîn bi hêsanî were fêm kirin.Xerabûn dê bibe sedema netemambûna genê, çi netemambûna gena referansa navxweyî be, çi jî netemambûna genê hedef be, dê bandorek mezin li ser daneyan bike.

Diyagrama şematîkî ya genê armanc û genê referansê, divê ne rast be

Testa astengkirinê (gelo nirxa CT di bin konsantasyona bilind an nizm de an şert û mercên din de tê tepisandin)

Vê jimarê wekî mînak bigire, nirxên Ct yên pênc kevanan wiha ne.Dabeşkirina nirxên CT-ê di navbera kevanan de nehevseng e, û nirxên Ct-ê di bin tansiyonên bilind û nizm de dereng dimînin, ku ev yek rewşa astengkirina PCR-ê ye.

Xala sereke: Di pêvajoya derxistina RNA de, divê em dev ji têgînên xelet berdin û yên rast saz bikin.

Fikra xelet ev e: Derxistina ARN tenê li dû hilberînê ye, difikire ku mîqdara ARN-ê çiqas mezintir be, ew çêtir e.Bi rastî, dema ku em pîvanê dikin, heke hejmara genan ne pir zêde be, hewcedariya me zêde bi ARNyê tune.Hejmara RNA ya ku hûn derdixin ji têra xwe zêdetir e.

Têgeha rast ev e:Divê derxistina RNA paqijî, yekbûn û hevgirtinê bişopîne.Paqijî dikare piştrast bike ku veguheztina berevajî ya paşîn nayê asteng kirin û dê dane ji hêla DNA ve neyên bandor kirin.Yekbûn hevsengiya rêzikên armanc û referansên hundurîn misoger dike.Tevhevî barkirina nimûneya domdar misoger dike.

MIQE (4) - veguhertina berevajî
Têgihiştina şaş: peydakirina hêjmara nimûneya bilind.
Konsepta rast: Li pey hevgirtinê (îstîqrar), bêyî ku mîqdara RNA-ya barkirî be, karbidestiya veguheztina berevajî domdar dimîne, û pê ewle dibe ku cûdahiyên di cDNA de dikarin bi rastî cûdahiyên di mRNA de nîşan bidin.
Em vê pêvajoyê bi diagramek şematîkî rave dikin:

Diyagrama şematîkî ya karbidestiya veguheztina berevajî, ne rast be
Berî her tiştî, divê em cûdahiya di navbera pêvajoya veguheztina berevajî û pêvajoya PCR de fam bikin.PCR di gelek pêvajoyên germkirinê û helandinê de derbas dibe, û perçeya armanc bi qatanî mezin dibe;dema ku veguheztina berevajî vê pêvajoyê tune ye, em dikarin bifikirin ku veguheztina berevajî bi rastî yek-bi-yek e Di dema prosesa dubarekirinê de, wekî gelek perçeyên RNA

ji ber ku hene dikarin bi qasî perçeyên Agahdariya cDNA-yê bistînin, divê heya nuha were fam kirin, ji ber ku perçeyên mezin û piçûk berevajî-transkrîb hatine kirin, û ne mimkûn e ku meriv li ser perçeyek hûr bibe.Û ji ber ku mîqdara ARNyê nisbeten piçûk e, mîqdara cDNA ya ku tê bidestxistin jî nisbeten hindik e, berevajî PCR, ku xwedan bandorek zêdekirinê ye, ji ber vê yekê di bingeh de ne gengaz e ku were tesbît kirin.

Encamên elektroforezên cDNA
Ya duyemîn, bi îdeal, veguheztina berevajî yek-bi-yek tête kirin, lê ti transkrîptaza berevajî ji her pargîdanî nikare vê bandorê bi dest bixe.Di bingeh de, karbidestiya piraniya transkriptazên berevajî di navbera 30-50% de derbas dibe.Ger wusa be, em ê xwedan karbidestiya veguheztina berevajî ya nisbeten domdar bin, ya ku em dixwazin di wêneyê de bibînin ev e: 3 ARN 2 cDNA distînin, 6 RNA 4 cDNA distînin, ji ber vê yekê çiqas nimûne were barkirin jî, karbidestiya veguheztina berevajî bi îstîqrar e.Em naxwazin rewşek bibînin ku karbidestiya veguheztina berevajî bêîstîqrar e û giraniya bilind tê asteng kirin.

Ji ber vê yekê, meriv çawa verast dike ka karbidestiya veguheztina berevajî aram e?Rêbaz pir hêsan e, hûn tenê hewce ne ku ceribandinek berhevdanê bikin: yek ev e ku hûn li cDNA-yê piştî ducarkirina RNA-yê ducar veguhezînin, û ya din jî dûbarkirina ducarîkirina piştî veguheztina berevajî di cDNA-yê de, û dûv re qPCR bikin da ku kavilê hatî bidestxistin bibînin Ma ew hevgirtî ye.Wekî xwendekarek top, divê hûn di nav hûrdeman de wê fêm bikin.Wekî ku li jêr tê nîşandan:

Dabeşkirina RNA û cDNA ji bo ceribandinê ka gelo karîgeriya veguheztina berevajî sabît e
Reverse transkriptase and kit
Meriv çawa dikare PCR-ya mîqdar a fluorescent a bêkêmasî xwedan transkriptaz û kîtek berevajî ya hêja be.Transkriptaza berevajî li gorî çavkanî, AMV an jî bi qasî du celeb tê dabeş kirinM-MLV, û performansa wan wekî ya ku di tabloyê de tê xuyang kirin yek e.

Çalakiya RNase H
RNase H Ribonuklease H e, navê çînî ribonukleaz H e, ku endoribonukleazek e ku dikare bi taybetî RNA di zincîra hîbrîd a DNA-RNA de hîdrolîze bike.RNase H nikare bendên fosfodîsterê yên di ADN an ARN-ya yek-zindî an jî dubendî de hîdrolîz bike, ango nikare ADN an ARN-ya yek-zindî an jî du-zindî bihelîne.Bi gelemperî di senteza rêzika duyemîn a cDNA de tê bikar anîn.

Tiştekî ecêb e.Em dibêjin ku transkrîptaza berevajî çalakiya RNase H heye, ne ku transkrîptaza berevajî RNase H dihewîne, û dibe ku nekaribe RNase H ji transkrîptaza berevajî veqetîne, dibe ku ji ber lihevhatina hin koman di transkrîptaza berevajî de Ev çalakî ji hêla transkrîptaza berevajî ve pêk tê.

Ji ber vê yekê, bêyî ku karbidestiya veguheztina berevajî ya AMV-ê ya bilindtir be, çalakiya wê ya RNase H hilberîna cDNA kêm dike.Bê guman, hilberînerên reagentê bi domdarî hilberên xwe xweştir dikin da ku çalakiya RNase H di transkrîptaza berevajî de bi qasî ku gengaz be ji holê rakin da ku hilberîna cDNA zêde bikin.
Germahiya annealing

Struktura duyemîn a RNA di germahiyên cûda de
Ji bo avahiya duyemîn a RNA-yê di germahiyên cihê de jimareya jor binihêrin, û amûra serhêl mFold bikar bînin da ku strukturên duyemîn ên perçeya armancê di bin şert û mercên germahîya taybetî û berhevkirina xwê de diyar bikin.Li 55°C, avahiya duyemîn a ARNyê hîn jî pir tevlihev e, transkrîptaza berevajî nikare bixebite, û avahiya duyemîn heya 65°C bi tevahî nayê çareser kirin, dema ku germahiya optimum a AMV û M-MLV ji vê germahiyê pir kêmtir e.
çi bikim?Struktura duyemîn bihevrahevkirina şablonê bixwe ye, ku dibe sedema pêşbaziyek bihêz di navbera prîmer û transkrîptaza berevajî û şablonê de, ku di encamê de rêzek pirsgirêkan wekî E-ya kêm û dubarebûna belengaz çêdike.

çi bikim?Tenê bi qasî ku mimkun dibe germahiya lêdanê zêde bikin.

Gelek hilberînerên reagentê bi endezyariya genetîkî ve transkriptaza xwe ya berevajî baştir dikin.Hin germahiya reaksiyonê zêde dikin, wek Jifan û Aidelai, û hin jî koma çalak a enzîma RNase H jê dikin da ku têkiliya di navbera enzîm û şablonê RNA de baştir bikin.Têkiliya bilind dikare bi pêşbaziyê strukturek duyemîn bişkîne û bi rêkûpêk bixwîne, û di heman demê de karbidestiya veguheztina berevajî jî pir baştir bike.
Xala sereke: Veguheztina berevajî girîngtir e ku meriv lihevhatina kargêriya veguheztina berevajî bişopîne (enzîm divê ne tenê bikêr be lê di heman demê de stabîl jî be), ji dêvla mîqdara nimûneya barkirî, heke ew ne PCR-ya mîqdar a fluorescent a bi taybetî mezin be, ew ê qet ne mumkun be.Gelek cDNA.
Hilberînerên cihêreng jî di peydakirina hevgirtinê de hin hewil dane.Mînakî, pir pargîdaniyan nuha veguheztina berevajî wekî kîtek standard ji bo firotanê pak kirine, ku ev vebijarkek baş e.
Mînakî, kîtên Rêzeya RT Easy ya Foregene:

RT Easy I (Pêşmixa sereke ji bo kîta senteza cDNA ya stûna yekem)

MIQE (5) - agahdariya genê armanc

Nîgara jorîn diyar dike
1. Gelo ev gen ji bo ceribandinên dubare bandorker e, bi gelemperî dikare bi ceribandinên dubare were verast kirin.
2. Gene ID, hûn dizanin.
3. Dirêjahiya genê, dirêjahiya giştî ya genê armanc bê guman pirsgirêk nîne.Dema sêwirana primersan, pê ewle bin ku dirêjahiya amplikonê di navbera 80-200 bp de ye da ku karîgeriyek çêtir a bihêzkirinê peyda bike.
4. Agahdariya berhevdana Sequence Blast, pêdivî ye ku genê armanc di genebankê de were berhev kirin da ku pêşî li zêdekirina ne-taybet bigire.
5. Hebûna pseudogenes.Pseudogen rêzek DNA ye ku dişibihe genek normal lê fonksiyona xwe ya normal winda dike.Ew pir caran di malbata pir-gene ya eukaryotes de heye.Bi gelemperî bi ψ tê temsîl kirin.Ew kopiyek DNA ya genomîkî ya ne-fonksîyonel a di genomê de ye ku pir dişibihe rêza genê kodker., bi gelemperî nayên transkrîbe kirin, û wateyek fîzyolojîkî ya zelal tune.
6. Helwesta destpêkên li gorî ekson û întronan.Di salên destpêkê de, dema ku me pirsgirêka gemarbûna DNA-yê çareser kir, me pir caran bala xwe dayê pozîsyonên primer, ekson û întronan, û bi gelemperî sêwirana primerên li seranserê intronan dihesiband da ku ji zêdekirina DNA-yê dûr bikevin.Ji kerema xwe li jimareya jêrîn binêre: reş întronan, şînên cihêreng exonan, pembe primerên hevpar, û sorê geş primerên ku întron vedigirin temsîl dike.

Skematîk, qet ne rast e
Ev çi plansaziyek bêkêmasî xuya dike, lê bi rastî, di pir rewşan de, primerên trans-întronê ne bi qasî ku tê xeyal kirin sêrbaz in, û ew ê di heman demê de bibin sedema zêdekirina ne-taybetî.Ji ber vê yekê awayê çêtirîn ku pêşî li gemariya DNA-yê bigire ew e ku DNA bi tevahî were rakirin.
7. Pêşbîniya pêkhatinê.Carek din vê nimûneyê bikar bînin, amûra serhêl mFold bikar bînin da ku strukturek duyemîn a perçeya armancê di germahiyek taybetî û giraniya xwê de diyar bikin.

Struktura duyemîn a RNA di germahiyên cûda de
Struktura duyemîn hevberdana şablonê bi xwe ye, ku dê bibe sedema pêşbaziyek bihêz di navbera pevgirêdana aşîkar û şablonê de, û şansên girêdana primerê kêmtir in, ku di encamê de rêzek pirsgirêkan wekî E-ya kêm û dubarebûna belengaz çêdike.Bi pêşbîniya nermalavê, heke pirsgirêkek avahiyek duyemîn tune be, ew ê pir baş be.Ger hebe, gotara me ya şopandinê dê bi taybetî nîqaş bike ka meriv çawa vê pirsgirêkê çareser dike.

MIQE (6) - qPCR Olîgonukleotîd

Ji bo PCR-ya mîqdar a fluorescent, yekem tiştê ku hûn her roj pê re têdikoşin derxistina RNA ye, û tiştê duyemîn dibe ku sêwirana pêşîn be.
Berî her tiştî, em hîn jî li gorî navnîşa kontrolê ya MIQE qaîdeyên di derbarê sêwirana pêşîn de kontrol dikin.Ew qas hêsan e ku pîvaz dikarin bikenin, û em dikarin wê bi yek hevokê biqedînin: rêz û pozîsyona sondaya pêşîn û rêbaza guherandinê bibînin.Ji bo rêbaza paqijkirina primer, senteza primer niha ew qas erzan e, qPCR hêjayî rêbazên paqijkirina PAGE û jorîn e, û agahdariya amûra sentezê ne girîng e.Gelek kes bi dehsalan destanan dikin û nizanin ku sentezker ABI3900 e.
Derbarê prensîbên sêwirana primerê de, ne hewce ye ku hûn wan bi rêzê ji bîr bikin, ji ber ku piraniya nermalava sêwirana primerê an amûrên serhêl dikarin van pirsgirêkan çareser bikin (alava serhêl primer3.ut.ee/ tê pêşniyar kirin), û 99.999% sêwirana pêşîn bi destan nayê kirin Binêrin, nivîskar carinan bi sedan abekeran dizayn dike, ger hûn yek bi yek bixwînin, dê yek bi yek bixwînin.
Piştî ku primers hatine sêwirandin tenê xalên jêrîn kontrol bikin:
1. Pêşbirkên sêwirandî yên nêzî dawiya 3'yê: Di rewşa karanîna primerên oligo dT de ji bo senteza rêza yekem a cDNA, li ber çavangirtina berevajîkirina veguheztina berevajî û yekbûna RNA, pêdivî ye ku primerên sêwirandî nêzikî dawiya 3' werin sêwirandin da ku kargêriya zêdekirinê baştir bikin.Ji bo ravekirina jêrîn wêneyek bikar bînin (rêyek tune ku meriv vê yekê fêm bike):

Çima divê primers nêzî dawiya 3'yê werin sêwirandin, divê ew ne rast be
2. Nirxa TM: Nirxa Tm di 55-65 ° C de ye (ji ber ku çalakiya exonuclease di 60 ° C de herî bilind e), û naveroka GC di 40% -60% de ye.
3. BLAST: Ji bo ku ji zêdekirina netaybetî ya genomê dûr bikevin, divê Blast ji bo verastkirina pêvek were bikar anîn.

MIQE (7) - pêvajoya qPCR

1. kit qPCR
Li gorî hewcedariyên MIQE, divê em di gotarê de şert û mercên bêkêmasî yên reaksiyonê, di nav de veavakirina pergala reaksiyonê ya PCR, çi kît tê bikar anîn, kî çêker e, pergala reaksiyonê çiqas mezin e, gelo rêbaza boyaxkirinê an jî rêbaza lêpirsînê tê bikar anîn, mîhengên bernameya PCR-ê bi zelalî vebêjin.Ajokarên Veteran bê guman dê bibînin ku heya ku kît were hilbijartin, agahdariya jorîn bi bingehîn têne destnîşankirin.
Heya nuha, çêkirin û hilberîna kîtên PCR-ya fluorescentî teknolojiyek pir gihîştî ye.Heya ku hûn hilberînerên zehf xirab hilbijêrin, îhtîmala pirsgirêkan ne zêde ye, lê dîsa jî em dixwazin çend xalan bi we re parve bikin:
Enzîma Taq-destpêka germ:Beşa herî girîng a PCR-ê enzîma Taq-a-destpêka germ e.Enzîmên germ-destpêka li sûkê bi gelemperî li du celeb têne dabeş kirin, yek enzîmek germ-destpêka bi kîmyewî ve hatî guheztin (hûn dikarin wê wekî vegirtina parafîn bihesibînin), û ya din enzîmek germ-destpêk e ji bo guheztina antîpîdê (girêdana antîjen-antîpoş).Guhertina kîmyewî rêyek destpêkê ya enzîmên germ-destpêk e.Dema ku germek diyarkirî tê, enzîm dê çalakiya xwe azad bike.Enzîma germ-destpêk a antîpodî-guhertî rêbazên biyolojîkî bikar tîne da ku çalakiya enzîmê asteng bike.Dema ku germahîyek diyar be, antîpoş dê wekî proteîn bê denaturîzekirin û bêçalak kirin, û çalakiya enzîmê dê were lîstin.

Lêbelê, karanîna vê yekê çi ye?Bi vî rengî ye, çalakiya berdana enzîmên antî-guhartî ji ya enzîmên ku bi kîmyewî hatine guheztin bileztir e, ji ber vê yekê di warê hestiyariyê de, enzîmên antî-guhartî xwedî avantajek piçûk in, ji ber vê yekê di kîteyên li sûkê de di bingeh de ti enzîmên guhezbar ên kîmyewî tune ne.Ger hebe, wê hingê teknolojiya vê hilberînerê hîn jî di serdema hezarsalî de asê maye.
Giraniya îyona magnesium:Di reaksiyona PCR-ê de giraniya îyona magnesium pir girîng e.Giraniya guncan a îona magnesium dikare serbestberdana çalakiya enzîma Taq pêşve bibe.Ger konsantre pir kêm be, wê çalakiya enzîmê bi girîngî kêm bibe;heke konsantasyon pir zêde be, dê zêdekirina ne-taybetî ya ku bi enzîmê ve hatî katalîzekirin zêde bibe.Kêmbûna îyonên magnezyûmê jî dê bandorê li lêdana primers, germahiya helandina şablonê û hilberên PCR bike, bi vî rengî bandorê li hilberîna perçeyên zêdekirî bike.Giraniya îyonên magnesium bi gelemperî di 25mM de tê kontrol kirin.Bê guman, ji bo kîtek baş, pêdivî ye ku hûrbûna îyonên magnesium baş were kontrol kirin.Hin bazirgan li reagentê kelûpelek îyona magnesium zêde dikin, ku dikare bandora sererastkirina otomatîkî ya giraniya îyona magnesiumê bi dest bixe.
Giraniya boyaxa fluorescent:Dye fluorescent, ku em bi gelemperî ji hêla DNA-ya DNA-ê ve hatî bikar anîn, ji ber vê yekê ku DNA-ya du-streded-ê bi vî rengî ve tête bikar anîn, ji ber vê yekê.
PS: Ji ber taybetmendiyên wê yên hesas ên ronahiyê, hilberên li sûkê bi gelemperî di lûleyên centrifûjê yên qehweyî de têne pak kirin (wek ku di wêneya jêrîn de tê xuyang kirin).Lêbelê, ev ê pirsgirêkek derkeve.Zehmet e ku meriv bibîne ka şilek di dema nimûneyê de tê kişandin an na.Di vî warî de, Qingke bi rastî ya herî bikarhêner-heval e (wek ku di wêneya jêrîn de tê xuyang kirin), û boriyek zelal di çenteyek tûncê ya zelal de tête pak kirin.Dûv re wê têxin nav çenteyek tin, li ber çavan rehetiya dûrketina ji ronahiyê û nimûneyê bigirin.Divê hûn jimareya hilberê rast hilbijêrin.TSE204 hebûnek lêçûnek super-bandor e, ku min dike ku ez dixwazim giya biçim.

Giraniya boyaxa fluorescentê jî pir girîng e.Ger konsantasyon pir kêm be, di qonaxa paşerojê de kêşeya amplification dê bilind nebe û ne bêkêmasî ye;heke konsantre pir zêde be, dê bibe sedema midaxeleya deng.Ji ber ku PCR-ya mîqdar a fluorescentî bi giranî bi nirxa CT ve girêdayî ye, heke hûrbûna rengê floransent bi rêkûpêk neyê sererast kirin, xala nizm ji xala bilind çêtir e.Bê guman, konsantasyona boyaxa guncan çêtirîn e.

ROX: Boyaxa ROX ji bo rastkirina xeletiyên sînyala fluorescence baş-baş têne bikar anîn.Hin hilberînerên amûran hewceyê kalibrasyonê dikin, lê yên din hewce nakin.Mînakî, karanîna amûra zêdekirina PCR-ya Real Time ya Thermo Fisher Scientific bi gelemperî pêdivî bi kalibrasyonê heye, di nav de 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, hwd. Talîmatên kîtê giştî dê wê diyar bikin.
QPCR Mix ya Foregene di heman demê de rengê ROX-ê jî heye, ku ji bo karanîna di modelên cihêreng de hêsan e.

Real Time PCR Kit-Taqman

Tedawiya girêdana hîdrojenê ya qels: Dermankirina bendên hîdrojenê yên qels mijarek teknîkî ye.Tiştek destanên gelek kîtan nexwendiye, lê yek ji wan behsa vê mijarê nekir.Bi rastî, ew pir girîng e.Tevlihevkirina bingehan bi giranî bi hêza girêdanên hîdrojenê ve girêdayî ye.Girêdanên hîdrojenê yên bihêz zêdekirina normal in, û girêdanên hîdrojenê yên qels dibin sedema zêdekirina ne-taybet.Ger girêdanên hîdrojenê yên qels nikaribin baş ji holê rabin, ji zêdekirina ne-taybetî nayê dûrxistin.Di çarçoveya nivîskarê de, tenê çend pargîdaniyan vê pirsgirêkê ferq kirine.Dema ku hûn kîtê bikirin, hûn dikarin binihêrin ka we ji bo kîta ku hûn dixwazin hilbijêrin di vî warî de çareseriyek fikiriye yan na.

Hêjmara reaksiyonê: Pergala 20-50ul bi gelemperî tê bikar anîn, û cildên piçûktir dibe ku bibe sedema xeletiyan.Bi gelemperî, rêwerzên kîtê dê karanîna cildên reaksiyona PCR-ê pêşniyar bikin.Aqilmend nebin û cildên piçûktir bikar bînin da ku lêçûn xilas bikin.armanca.Hêjmara ku ji hêla bazirganan ve hatî pêşniyar kirin bi rastî hatî ceribandin, û dibe ku ew nikaribin pirsgirêka xeletiyên ku ji hêla cildên piçûk ve têne çêkirin çareser bikin.
2. Çêker û hejmara gotara plakaya tube
Her kes prensîba PCR-ya mîqdar a fluorescent dizane.Komkirina floransê bi giranî bi kulpên lûleya PCR ve tê kirin.Dema ku hilberên PCR hilbijêrin, bala xwe bidin du xalan: veguheztina ronahiyê ya baş û ji bo amûrê maqûl.Bi gelemperî, panel û boriyên markayên sereke baş in, lê divê hûn di warê adaptasyonê de bi baldarî hilbijêrin, wekî din hûn ê nikaribin amûrê bikar bînin.

4. zanîna asta jorîn

MIQE (8) - erêkirina qPCR
Ev pêşengiya qPCR ya herî mezin e!Li vir ewqas leheng ketine qûmê.Bê guman, di heman demê de mimkun e ku hûn bextewar bin û genên ku we lêkolîn kirine sade bin, ji ber vê yekê hûn di şikefta berfê de li ber bayê baz didin.Agahdariya verastkirinê ya qPCR ji bo ceribandina pêbaweriya daneyê tê armanc kirin.Em agahdariya verastkirinê ya pêwîst wiha navnîş dikin:

1.Testa taybetmendiyê
Taybetmendiya zêdekirina gena armancê bi kontrolkirina ka wêneya elektroforez yek band e tê ceribandin;verification sequencing;kevza helandinê ji bo dîtina ka nexşeya lûtkeyê yekane ye;verastkirina digestiya enzîmê û rêbazên din.
Li vir, em li ser tew analîza zêdekirina ne-taybetî bi karanîna rêbaza helandina kelûpelan.Bi gelemperî, dema ku em primers sêwiran dikin, pêdivî ye ku mezinahiya perçeya hilberê di navbera 80-200 bp de be, ku ev germahiya helandina hilberê PCR 80-85 °C dike.Ji ber vê yekê, heke lûtkeyên cûrbecûr hebin, divê hilberên din ên zêdekirina ne-taybetî hebin;heke lûtke di binê 80°C de xuya bibe, ew bi gelemperî wekî dimerek pêşîn tê hesibandin;heke lûtkeya li jor 85°C xuya bibe, ew bi gelemperî wekî tevlihevbûna DNA an zêdekirina netaybetî ya perçeyên mezin tê hesibandin.
Nîşe: Carinan di 80°C de tenê lûtkeyek yek heye.Di vê demê de, divê ku ev têgihîştin.Ihtîmal e ku encamên zêdekirinê hemî dimerên pêşîn in.

Kevirê helînê ya normal (pişkek yekane bêyî zêdekirina ne-taybetî)

Kûçek helandinê ya pirsgirêk (zêdekirina ne-taybetî ya lûtkeyên xapînok)
【Analîzkirina dozê】

Pezek sereke heye, lê dimera pêşîn cidî ye
Kevirê helîna yek-lûtkê ya di jimareya jêrîn de dikare bi hêsanî çavên we bixapîne, bifikire ku ew ceribandinek bêkêmasî ye, lê encam bi tevahî xelet e.Di vê demê de, divê em li germahiya helandinê binêrin.Germahiya lûtkeyê di binê 80 ° C de ye, ku bi tevahî primer-dimer e.

Parçeyek armanc tune, hemî dimerên pêşîn
Li vir birayê min nikare bisekine.Wêneyê jêrîn wêneyek e ku bi têlefonek desta ji min re hatî şandin e.Reagentên ku wî bikar anîn hemî marqeyên bi gelemperî di pîşesaziyê de têne bikar anîn.Ew ji yek T-prefix marqeyek din T-prefix guhert.Ez difikirim ku we berê texmîn kiriye.Scumbag ji min re giriya: "Reagenta ku di wêneya yekem de hatî bikar anîn pir baş e, û lûtke yekane ye.Dûv re, piştî karanîna reagenta ku we pêşniyar kir, ew dibe mîna wêneya duyemîn, bi lûtkeyên tevlihev.Te ez bextreş kirim."
Du grafikan ji hev veqetînin.Di nihêrîna pêşîn de, yek lûtkeyek yek heye, û ya din lûtkeyek ducar heye.Bêaqil e, lûtkeyek yekane bê guman baş e.Ev rast e?
Ji Dou E xirabtir, ger ez du wêneyan di wêneya jêrîn de bixim, hûn ê tavilê fêm bikin.Bi rastî, em bi vî rengî wêneyê bi hêsanî felc dibin.Piştî analîzek bi baldarî, me dît ku: lûtkeya jimareya yekem di 75 ° C de ye, ku bi tevahî dimera pêşîn e;lûtkeya jimareya duyemîn di 75°C û 82°C de xuya dike, bi kêmanî hene Hilber xuya dike.

Wêneyên bersivên xwendekaran
Ji ber vê yekê pirsgirêka bingehîn ne pirsgirêka reagentan, lê pirsgirêka sêwirana pêşîn e.Di heman demê de, ew jî îspat dike ku hin marqeyên mezin ne bi kalîteya hesin in, û ew tiştê ku birayê min berê gotiye jî îsbat dike: Ew ne marqeya reagentê ye ku gotara we piştgirî dike.Ew gotara we ye ku marqeya reagentan diparêze.Bifikirin, ger rezîl reagentan neguheranda, dê daneyên xelet ji kovarê re bihata şandin, û ya ku dê bibe dê bibe trajediyek.
2. Nirxa Ct ya kontrola vala
Rave nekin, ger kontrola vala nirxek Ct hebe, ma ew ne qirêj e?Lêbelê, hûn hîn jî hewce ne ku fêm bikin ka kîjan kontrola vala nirxek Ct heye.Ger ew NTC be, ev tê vê wateyê ku DNA-ya biyanî wekî gemariya reagentê heye.Ger ew NRT be, ev tê vê wateyê ku RNA-ya ku hatî derxistin xwedan ADN-ê ye.
3. Kûreya standard
Tevlî formula şil û hesabkirinê, karbidestiya PCR dikare bi formula tê hesibandin.Ji bo ceribandinek bêkêmasî pêdivî ye ku ziraviya kêşeya standard nêzikî 3.32 bibe, û R² nêzî 0.9999 bibe.
4. Rêzeya dînamîkî ya xêz
Rêjeya dînamîk a reaksiyonê xêzik e.Li gorî şablona ku ji bo hilberandina kêşeya standard tê bikar anîn, rêza dînamîkî divê bi kêmî ve 5 gradientên konsantasyonê bigire nav xwe, û balê bikişîne ser guhartina nirxên Ct di pileyên giraniya bilind û pileyên giraniya nizm de.
5. Rastbûna Detection
Guhertinên di encamên qPCR de, ango, dubarebûna qels, ango rastbûna nebaş, ji hêla gelek faktoran ve têne çêkirin, di nav de germahî, konsantasyon û xebitandin.Ji ber ku hejmara kopî kêm dibe, rastbûna qPCR bi gelemperî kêmtir kontrol dibe.Bi îdeal di hundurê guhertoya ceribandinê de, ev guhertoya teknîkî divê ji guhertoya biyolojîkî cûda be, û dubareyên biyolojîkî dikarin rasterast cûdahiyên statîstîkî yên di encamên qPCR de di navbera kom an dermankirinê de çareser bikin.Bi taybetî ji bo vekolînên teşhîs, divê di nav malper û operatoran de rastbûna herî baş a di nav-assay de (dubarekirin) were ragihandin.
6. Karbidestiya tespîtkirinê û LOD (di qPCR-a multiplex de)
LOD ji sedî 95-ê nimûneyên erênî yên ku hatine tespît kirin asta herî kêm e.Bi gotinek din, hûrbûna LOD-ê ya ku di nav komek dubareyên genê armanc de heye divê ji% 5-ê reaksiyonên têkçûyî derbas nebe.Dema ku analîza qPCR-ya multiplex dike, nemaze ji bo tespîtkirina hevdemî mutasyonên xalî an jî polîmorfîzmê, qPCR-a multiplex hewce dike ku delîlan peyda bike ku rastbûna perçeyên pirjimar ên armancê di heman lûleyê de tawîz nade, tespîtkirina pirjimar û tespîtkirina yek lûleyê Pêdivî ye ku bikêrhatî û LOD yek bin.Bi taybetî dema ku genên hedef ên bi konsantresyona zêde û genên hedef ên bi konsantresyona kêm bi hevdemî werin zêdekirin, divê bal were kişandin ser vê pirsgirêkê.
Pirsgirêk û çareserîBi gelemperî, pirsgirêkên ku bi gelemperî di qutkirina qPCR de rû didin li ser aliyên jêrîn hûr dibin:
· amplification nonspecific
·Hilbijartina dijwar a kombûna primerê û aloziya bi primer-dimeran
·Germahiya lêdanê nerast e
· Struktura duyemîn bandorê li ser bandorkeriya zêdekirinê dike
amplification nonspecific
amplification ne-taybetdiqewime, bi gelemperî tête fikirîn ka sêwirana pêşîn ne guncan e, lê heke hûn di guheztina primers de ne bilezin, hûn dikarin pêşî rêbazên jêrîn biceribînin (prensîp jî pêvekirî ye):
·Germahiya lêdanê zêde bikin - hewl bidin ku girêdanên hîdrojenê yên qels nekarin biparêzin;
·Dema lêdan û dirêjbûnê kurt bikin - şansê qelsbûna girêdanên hîdrojenê kêm bikin;
·Kêmkirina kombûna primerê - şansê girêdana primerên zêde û herêmên ne-armanc kêm bike;
Karbidestiya amplification kêm
Rewşa berevajî zêdekirina ne-taybetî - berevajîkirina zêdekirina kêm, û tedbîrên ji bo mijûlbûna bi karbidestiya kêmbûnê re berevajî ne:
·Dema lêdanê û dirêjbûnê dirêj bike;
·PCR-ya sê-gavekî biguhezînin û germahiya lêdanê kêm bikin;
· Zêdekirina konseya primer;
Ps: Gelek xwendekarên mezûn ên ku di salên 90-an de ji dayik bûne ne amade ne ku bixwînin ka meriv çawa ceribandinan xelet dike, û hêvî dikin ku kît bikaribe pirsgirêkê bi tevahî çareser bike (heke hûn dixwazin biçin pargîdaniyek reagentê ku lêkolîn û pêşkeftinê bike piştî mezûniyetê), bi rastî, çêkerên reagentê jî bi vî rengî difikirin, ez hêvî dikim ku ew ehmeq e. Dema ku hûn wê bi dest bixin dikare were bikar anîn, ji ber vê yekê pirsgirêkek reagentê ya ne-taybetî ku di nav de hilberîneran heye çareser bike. Faktorên hilgirtina H-bondê qels.Ji bo ku pirsgirêk bi hêsanî çareser bikin, ehmeq hîn jî pêdivî ye ku danasîna pargîdaniya reagentê bixwînin da ku bibînin ka faktorek heye ku girêdanên hîdrojenê yên qels digire.
Hilbijartina dijwar a berhevdana primer û pirsgirêka bi primer-dimeran
Rêbaz 1: Bi gelemperî, rêwerzên kîtê ji bo qPCR pergalên pêşniyar dikin û hûrgelên pêşîn ên pêşniyarkirî hene.
Rêbaz 2: Bi danîna gradienta konsantasyona aşîkarê verastkirin.Wêneyê jêrîn ji pargîdaniyek hatî dizîn da ku nîşan bide.Di jimareya jêrîn de encamên mîqdar ên fluoresenceyê yên ku bi sê gradientên kombûna primerê hatine çêkirin (100nM, 250nM, 500nM) û çar gradientên berhevdana şablonê (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng) nîşan dide.Nirxa Ct ya encamên ceribandinê bi vî rengî tête diyar kirin:

Hilbijartina Kêmbûna Serpêhatiyê Her konsantasyona destpêkê bi vî rengî di nav rêzek de bi hev ve girêdin:

Hilbijartina kombûna primerê diyar e, pêwendiya xêzikî ya kombûna primerê ya 100nM û 250nM çêtir e, û pêwendiya xêzikî ya kombûna primerê ya 500nM bi rêkûpêk xirab e.Di 100nM û 250nM de, nirxa Ct ya 250nM nisbeten piçûk e, ji ber vê yekê giraniya pêşîn a çêtirîn 250nM e.Bi gelemperî primer-dîmerên giran di çerxa helandinê de têne dîtin.Ger primerên sêwirandî nikaribin ji primer-dimeran dûr bikevin?
Rêbaz 3: Hêjmara primerayan kêm bikin û germahiya lêdanê zêde bikin (ne hewceyî ravekirinê ye).
Nirxa ampîrîkî ya germahiyê 60°C ye.Heke hûn nebawer in, meriv çawa germahiyek birêkûpêk maqûltir hilbijêrin?Bersiv wekî bijartina berhevoka pêşîn e -testa gradient.Ji bo ronîkirina pirsgirêkê wêneyek ji pargîdaniya Bio-rad bigirin.Ji bo zêdekirina perçeyek armancek diyarkirî, heşt gradientên germahiyê, her yek bi sê dubareyan, destnîşan bikin, û kêşeya mezinbûnê ya hatî wergirtin wiha ye:

Hilbijartina germahiya paqijkirinê:
· 70°C, 69°C - Di bingeh de, primers nayên berhev kirin, ji ber vê yekê zêdekirin tune.
·67.3°C - Di destpêkê de mîqdarek piçûktirbûnek heye, û nirxa Ct nisbeten mezin e.
·64,5°C—— Nirxa Ct kêm dibe.
·Li 60,7°C, 58,0°C, 56,2°C, û 55,0°C, nirxên Ct bi bingehîn bi îstîqrar bûn, lê nirxên floransê yên dawîn cuda bûn.
Çawa hilbijêre?Prensîp: Prensîba yekem nirxa Ct ya bilind e.Ji bo heman nirxa Ct-ê, germahiyek germbûnê ya bilind hilbijêrin da ku ji dimerîzasyon û zêdekirina ne-taybet dûr bikevin.Her çend di 55°C de nirxek floransê ya bilindtir hebe jî, dibe ku tê de dimer an zêdebûnek ne-taybetî hebe.
Lê heke hûn bi qasî xwe jîr bin, hûn ê bê guman bifikirin: Bi mentiqî, heke reaksiyona PCR pir taybetî be, heya ku kombûna primer ji hewcedariya hindiktirîn derbas bibe, xalên bilind û nizm divê tu bandorek nebin, mîna boyaxên fluorescent û dNTP.Bi rastî, heya ku germahiya lêdanê bi rêkûpêk were xweş kirin, dê bandora giraniya primerê li ser nirxa Ct bi xwezayî kêm bibe.

Germahiya lêdanê bi rêkûpêk tête xweş kirin, û dê bandora hûrbûna pêşîn a li ser CT kêm bibe
Struktura duyemîn bandorê li kargêriya amplifikasyonê dike
Werin em wêneyê ji Bio-rad bigirin da ku pirsgirêkê ronî bikin.Di heman demê de ew pileyek germahiyê dîzayn dike da ku genek bi avahiyek duyemîn zêde bike.

Struktura duyemîn derdikeve holê
Tê dîtin ku her ku pileya germahiyê kêm dibe, hilber dest pê dikin û nirxa Ct ber bi pêş ve diçe, digihîje nirxa herî kêm di 60,7 °C de, û dûv re her ku pileya germahiyê kêm dibe, nirxa Ct mezintir dibe.Berevajî vê, her ku germahî zêde dibe, avahiya duyemîn vedibe û karbidestiya zêdebûnê zêde dibe.Piştî gihîştina germahiyek diyarkirî, zêdekirina germahiyê nikare karbidestiya amplifikasyonê baştir bike.Ji ber ku primers di vê demê de bi îstîqrar nayên berhev kirin.Ji ber vê yekê,li germahiya bi nirxa Ct ya herî kêm bigerin, ku germahiya herî baş e ji bo zêdekirina şablonê avahiya duyemîn!Bê guman, ehmeqên biaqil divê zanibin ku ger ne hewce be, çêtirîn e ku primers biguhezînin û ji herêma avahiya duyemîn dûr bixin.
5. Asta serîlêdanê
MIQE-Analîzkirina Daneyên

Analîzkirina daneyê bi giranî ji hêla amûra PCR-ya mîqdar a fluorescent ve tê dayîn.Di gotara berê de, gelek xebatên analîzkirina daneyê hatine kirin, wek mînak kontrolkirina vala, ku di sêwirana ceribandinê de hate rave kirin.Genên referansa navxweyî, hejmarên dubare û hwd hatine zelal kirin., li vir em bi giranî serîlêdana qPCR rave dikin.
qPCR bi berfirehî tê bikar anîn, û verastkirina ceribandinê û teşhîsa asîda nukleîk senaryoyên herî gelemperî têne bikar anîn.
hejmartina mutleq
Têketin (konsantrasyona destpêkê) bi hejmara dewreyan re têkiliyek rêzik heye.Kulek standard dikare ji standardek bi jimareya kopiya destpêkê ya naskirî were kişandin, ango têkiliya xêzikî ya reaksiyona zêdekirinê dikare were bidestxistin.Li gorî nirxa Ct ya nimûneyê, hûrbûna di nimûneyê de dikare were hesibandin.Hejmara şablonên ku tê de hene.

Rêbaza Hesabkirina Hêjdar a Absolute
Pêdivî ye ku mîqdarkirina mutleq li ser bingeha kêşeya standard be.Ji bo çêkirina kelek standard, standardek pêdivî ye.Bi gelemperî, standard plasmidek e ku bi klonkirina genê armanc tê wergirtin.Çima ew plasmid e?Ji ber ku ADNya plazmîdî ya dorhêl a herî bi îstîkrar e.Hilbera standard di 5 û 6 gradientan de li gorî rêjeya duqatkirinê (teqandina 10 qatî) bişewitînin, û dema ku dirijînin bala xwe bidin yekrengiyê.Bila nirxa Ct di navbera 15-30 de bikeve.

Amadekirina standard
Di heman demê de, divê nimûneya ku were ceribandin jî li gorî vê yekê were rijandin (faktora dirûnê bi bîr bîne), û nirxa Ct jî divê di navbera 15-30 de bikeve.Hilbera standard + nimûneya ku were ceribandin bi hev re li ser makîneyê têne danîn.Piştî rêvekirinê, bi maddeya standard kelekek standard hate çêkirin, û nimûneyên ku bêne ceribandin hatin birin nav kaxeza standard da ku berhevdanê were hesibandin.
Pîvana HBV ya vîrûsa Hepatît B pîvanek bêkêmasî ya tîpîk e, ku dikare hejmara kopiya vîrusê di 1 ml xwînê de bihejmêre.
Hesabkirina hejmara kopî
Kêmbûna nimûneyê ya ku were ceribandin (ng/ul) = OD260 × 50 ug/ml × faktora rijandinê
Giraniya molekulê ya nimûne = hejmara bingehîn × 324
Hejmara kopî ya nimûneya ku tê ceribandin (kopî/ul) = giraniya nimûneya ku tê ceribandin / giraniya molekulê ya nimûneyê × 6 × 1014

Rêbaza hesabkirina hejmara kopî

Ya jorîn ji bo destnîşankirina mîqdarê rêbaza hesabkirinê ye.Ev pirsgirêkek matematîkî ye ku piştî qedandina dibistana navîn dikare were çareser kirin, û pirsgirêkên matematîkî bi gelemperî bi komputeran têne çareser kirin.Heke hûn fêm nakin, hûn dikarin werin danûstendinê.
hejmartina nisbî
Pîvana têkildar bi piranî di lêkolîna zanistî de tê bikar anîn.Di 1ml xwînê de çend vîrus hene, û ew vîrusek DNA ye, ev bûyerek bi rêkûpêk diyarker e: mîqdara xwînê dikare were destnîşankirin, û vîrusa DNA-yê nisbeten domdar e.Lêbelê, ji me re dijwar e ku em hejmara kopiyên transkrîpsiyona genek di pelekê de bidin ber hev, ji ber ku dijwar e ku meriv mezinahî, giranî û nermiya pelê diyar bike, hêjmara RNA-ya ku tê derxistin zehmet e ku were destnîşankirin, û kargêriya transkrîpsiyona berevajî jî dijwar e ku were destnîşankirin, ango her gav dibe ku daneyên ceribandinê nekarin xeletiyan bikin.
Ji ber vê yekê, pîvana têkildar divê hêmanek destnîşan bike:genê referansa navxweyî.
Bi gotinek din, hejmartina têkildar bi rastî berhevokek di navbera gena armanc û gena referansa navxweyî de ye.Li beramberî heman tevn û heman hucreyê, bandora mezinahiya nimûneyê, mîqdara derxistina RNA, karbidestiya veguheztina berevajî, û kargêriya PCR-ê bi rengek piçûktir e.Ji ber mezinahiya nimûneya piçûk, hem genên referansa navxweyî û hem jî genên armanc bi rêkûpêk kêm bûne.Ji ber vê yekê me berê giranî li yekrêzî û aramiyê digirt.
Genên referansa navxweyî bi gelemperî negenên malê(genên malparêz), ku ji çînek genan re vedibêjin ku di hemî şaneyan de bi îstîqrar têne diyar kirin, û hilberên wan ji bo domandina çalakiyên bingehîn ên jiyanê yên hucreyan hewce ne.
Vê têgehê tevlihev nekin.Genên malxweyî peyvên fonksiyona biyolojîkî ne, dema ku genên referansa navxweyî termên teknîkî yên ceribandinê ne.Berî ku ew wekî genên referansa hundurîn werin hilbijartin, pêdivî ye ku genên malxwê erêkirinê derbas bikin.
Mînakî, me di jimareya jêrîn de çend genên xwedîkirina malê hilbijart da ku asta îfadeya wan di şaneyên tevnvîsê yên cihêreng de biceribîne, û dît ku astên vegotinê yên β-2-mîkroglobulîn ji yên sê genên din pir cûda bûn, ji ber vê yekê ew nekarin wekî genên referansa navxweyî werin bikar anîn.

Piştî têgihîştina fonksiyona rastkirina gena referansa navxweyî, ji ber danasîna gena referansa navxweyî du algorîtma têne derxistin.
· Rêbaza çerxa standarda ducar
·2 - Rêbaza △△Ct (rêbaza berhevdana nirxa CT)
Heke hûn bala xwe didin lêkolîna celeb û fonksiyonên genan, ji kerema xwe dev ji lêkolîna li ser algorîtmayan berdin û rasterast formulan bikar bînin, an rasterast makîneyan bikar bînin;heke hûn di matematîk û endezyariyê de zilamek rast in, ji kerema xwe xwe azad hîs bikin.
rêbaza curve standard du qat
Genê armanc û gena xwedîkirina malê ya nimûneya kontrolê û nimûneya ku tê ceribandin bi rêça standard bihejmêre, û dûv re nirxa têkildar li gorî formula hesabkirinê, ku asta vegotina têkildar e, hesab bike.
Avantaj: analîzek hêsan, xweşbîniya ceribandinê ya bi nisbî hêsan
Kêmasî: Ji bo her genê, divê her dora ceribandinan xêzek standard çêbike
Serlêdan: Di lêkolîna rêziknameya derbirrîna genê de yek ji du rêbazên mîqdar ên têkildar ên herî gelemperî û naskirî ye
Formul wiha ye:

Nimûne ev in:

Li ser bingeha encama jimareyî mîqdara nisbî hesab bikin
2 - Rêbaza △△Ct (rêbaza berhevdana nirxa CT)

Awantaj: Ne hewce ye ku meriv kelek standard çêbike
Kêmasî: Tê texmîn kirin ku karbidestiya zêdekirinê nêzî %100 e;veqetîna standard < 5% e, û qertafa standard û karîgerîya di navbera her zêdebûnê de hevgirtî tê hesibandin;optimîzasyona şert û mercên ceribandinê tevlihevtir e.
Serlêdan: Di lêkolîna rêziknameya derbirrîna genê de yek ji du rêbazên mîqdar ên têkildar ên herî gelemperî û naskirî ye

Bê guman, karbidestiya zêdekirinê bi gelemperî ne gengaz e ku bêkêmasî be 1. Rêbaza serrastkirinê: Heke em zanibin ku gena armanc û gena referansê xwedî heman karîgerîya zêdekirinê ne, lê kargêriya zêdekirinê ne wekhevî 1 e, wê demê 2-△△Ct dikare wekî: (1+E )△ 1+E ) △ 5-amplification, eger emplîfîkasyon, ji bo 1+E ) △ 5-amplification emplification, , wê hingê formula hesabkirinê dikare bi 1,95-△△Ct were rast kirin
Heya nuha, naveroka di derbarê PCR-ya mîqdar a fluorescent de bi dawî bûye.