Bingeha sêwirana Primer (% 99 pirsgirêk dikarin bêne çareser kirin)
1. Dirêjahiya destpêkê: Pirtûka dersê 15-30 bp, bi gelemperî li ser 20 bp hewce dike.Rewşa rastîn çêtir e ku 18-24bp be da ku taybetmendiyê misoger bike, lê her ku dirêjtir çêtir be, arîmera pir dirêj jî dê taybetmendiyê kêm bike, û hilberînê kêm bike.
2. Demjimêra zêdekirina Primer: 200-500bp guncan e, û perçe dikare di bin şert û mercên taybetî de 10kb were berfireh kirin.
3. Bingeha Primer: Divê naveroka G+C 40-60% be, pir hindik bandora zêdekirina G+C ne baş e, pir G+C hêsan e ku bandên ne-taybet xuya bike.ATGC herî baş bi korfelaqî tê belavkirin, ji komên ji 5 zêdetir purine an pyrimidine nucleotides dûr dikeve.Pir-gc ji bo dawiya 5' û rêzikên navîn ji bo zêdekirina îstîqrarê, ji GC-ya dewlemend di dawiya 3' de, ji 3 bazên paşîn re GC tune, an ji 3 ji 5 bingehên paşîn re GC tune.
4. Ji avaniya duyemîn di primeraran de dûr bixin, û ji temamkirina di navbera du arîmanan de, nemaze ji temamkirina di dawiya 3 'yê de dûr bisekinin, wekî din dê dimera pêşîn çêbibe û dê bendên zêdekirî yên ne-taybetî çêbibin.
5. Bingehên li 3 'dawiya primeraran, nemaze bazên paşîn û yên pêşdawî, divê bi hişkî werin berhev kirin da ku ji ber têkçûna PCR ji ber bazên termînalê yên nehevkirî dûr bikevin.
6. Primer hene an dikarin bi cihên perçebûnê yên guncav re werin zêdekirin, û rêzika armancê ya zêdekirî divê bi tercîhî xwedî cihên perçebûnê yên guncan be, ku ji bo analîza veqetandinê an klonkirina molekulî pir bikêr e.
7. Taybetmendiya prîmeran: primer divê bi rêzikên din ên di databasa rêza asîdên nukleîdî de homologiyek diyar nebin.
8. Fêr bibin ku hûn nermalavê bikar bînin: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Ev sêwirana serhêl çêtirîn dixebite).
Naveroka jorîn dikare bi kêmî ve 99% pirsgirêkên sêwirana pêşîn çareser bike.
Hûrguliyên sêwirana primer kontrol bikin
1. Dirêjahiya Primer
Dirêjahiya pêşîn a gelemperî 18 ~ 30 bingeh e.Bi gelemperî, faktora herî girîng a ku germahiya pijandinê ya aşîtê diyar dike dirêjahiya aşîtê ye.Germahiya lêdanê ya primer bi gelemperî tê hilbijartin (nirxa Tm -5℃), û hin rasterast nirxa Tm bikar tînin.Formulên jêrîn dikarin werin bikar anîn da ku bi hûrgulî germahiya lêdanê ya primers were hesibandin.
Dema ku dirêjahiya primerê ji 20 bp kêmtir be: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Dema ku dirêjahiya primerê ji 20 bp mezintir e: 62,3℃+0,41℃(%GC)-500/dirêj-5℃
Digel vê yekê, gelek nermalava di heman demê de dikarin werin bikar anîn da ku germahiya lêdanê hesab bikin, prensîba hesabkirinê dê cûda be, ji ber vê yekê carinan dibe ku nirxa hesapkirî kêmasiyek piçûk hebe.Ji bo xweşbînkirina reaksiyonên PCR-ê, primerên herî kurt ên ku germahiya annealkirinê ne kêmtir ji 54℃ piştrast dikin, ji bo çêtirîn bandor û taybetmendî têne bikar anîn.
Bi tevayî, taybetmendiya primer ji bo her nukleotîdek zêde bi faktorek çar zêde dibe, ji ber vê yekê dirêjahiya pêşîn a herî kêm ji bo pir serlêdanan 18 nukleotîd e.Sînorê jorîn ê dirêjahiya primer ne pir girîng e, bi giranî bi reaksiyonê ve girêdayî ye.Ji ber entropiyê, primerê her ku dirêjtir be, rêjeya ku ew bi ADN-ya armancê ve girêdide ew qas kêmtir dibe da ku ji bo girêdana DNA polîmerazê şablonek dubendî ya domdar ava bike.
Dema ku nermalava ji bo sêwirana primeran tê bikar anîn, dirêjahiya primers dikare bi nirxa TM-yê di rêzê de were destnîşankirin, nemaze ji bo primerên PCR-ya mîqdar ên fluorescence, divê TM=60℃ an jî wusa were kontrol kirin.
Naveroka 2.GC
Bi gelemperî, naveroka G+C di rêzikên destpêkê de 40% ~ 60% e, û naveroka GC û nirxa Tm ya cotek destpêk divê were hevrêz kirin.Ger primer xwedan meyla GC an AT ya ciddî be, mîqdara guncan a A, T an G û C dûvikê dikare li dawiya 5 'ya primerê were zêdekirin.
3. Germahiya annealing
Germahiya lêdanê divê 5 ℃ ji germahiya zincîran kêmtir be.Ger hejmara bingehên primer hindik be, germahiya lêdanê dikare bi guncan were zêde kirin, ku dikare taybetmendiya PCR zêde bike.Ger hejmara bazdan mezin be, germahiya helandinê dikare bi guncan were kêm kirin.Cûdahiya germahiya lêdanê ya di navbera cotek destpêkek 4℃ ~ 6℃ de dê bandorê li ser hilberîna PCR neke, lê bi îdeal germahiya annealkirinê ya cotek destpêk yek e, ku dikare di navbera 55℃ ~ 75 ℃ de diguhere.
4. Ji qada avahiya duyemîn a şablonê amplification dûr bixin
Baştir e ku dema hilbijartina perçeya zêdekirî ji devera avahiya duyemîn a şablonê dûr bikevin.Struktura duyemîn a stabîl a perçeya armancê dikare ji hêla nermalava komputerê ya têkildar ve were pêşbînîkirin û texmîn kirin, ku ji bo hilbijartina şablonê alîkar e.Encamên ceribandinê destnîşan dikin ku dema ku enerjiya azad (△G) ya herêma ku were berfireh kirin ji 58,6 lkJ/mol kêmtir be, berfirehbûn bi gelemperî neserkeftî ye.
5. Nehevhatina bi DNA-ya armancê re
Dema ku rêzika DNA-ya armancê ya zêdekirî mezin be, dibe ku destpêkek bi gelek beşên DNA-ya armancê ve girêbide, û di encamê de gelek bend xuya dibin.Vê carê pêdivî ye ku meriv ceribandina nermalava BLAST, malperê bikar bîne:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Hilbijêre Align du rêzikan (bl2seq).
Çêkirina rêzikên pêşîn li devera 1 û rêzikên DNA yên armanckirî li devera 2 veguhezîne, û BLAST îmkanên temamker, antîsens, û yên din dihesibîne, ji ber vê yekê bikarhêner ne hewce ne ku ferq bikin ka her du zincîre zincîrên hestî ne.Her weha hûn dikarin jimara GI-ê jî têkevin ger hûn jimareya GI ya rêzikê di databasê de zanibin, ji ber vê yekê hûn neçar in ku beşek mezin a rêzikê bişopînin.Di dawiyê de, Align li 3-ê bikirtînin da ku bibînin ka di ADN-ya armancê de cîhên homolog hene an na.
6. Termînalê Primer
Dawiya 3 'ya primerê cîhê ku dirêjkirin dest pê dike ye, ji ber vê yekê girîng e ku meriv nelihevkirinên li wir dest pê bike nehêle.Divê dawiya 3'yê ji 3 G an C li pey hev zêdetir nebe, ji ber ku ev ê bibe sedem ku aprimer bi xeletî li herêma rêza dewlemendkirina G+C were vedan.Dawiya 3' nikare avahiyek duyemîn çêbike, ji bilî reaksiyonên taybetî yên PCR (AS-PCR), dawiya 3' ya primerê nayê hevber kirin.Mînakî, heke devera şîfrekirinê were zêdekirin, divê dawiya 3 'ya primerê di pozîsyona sêyemîn a kodonê de neyê qedandin, ji ber ku pozîsyona sêyemîn a kodonê meyla dejenerasyonê ye, ku dê bandorê li taybetmendî û karbidestiya zêdekirinê bike.Dema ku primerên pêvekirinê bikar tînin, serî li tabloya karanîna kodonê bidin, bala xwe bidin tercîha biyolojîkî, di dawiya 3'yê de primerên pêvekirinê bikar neynin, û pîvazek pirtir a primeran bikar bînin (1uM-3uM).
7. Avahiya duyemîn a destpêk
Pêdivî ye ku primers bixwe xwedan rêzikên hevgirtî nebin, wekî din ew primers bixwe dê di nav strukturên porê porê de biqelişin, û ev avahiya duyemîn dê bandorê li girêdana primers û şablonan ji ber astengiya sterîkî bike.Ger dîwanek çêkirî were bikar anîn, divê bingehên temamker ên domdar ên primerên xwe ji 3 bp mezintir nebin.Pêdivî ye ku di navbera her du destpêkeran de temamkerî tune be, nemaze ji hevgirtina temamker a dawiya 3 'yê dûr were girtin da ku pêşî li pêkhatina dimerên primerê bigire.Bi gelemperî, divê di navbera cotek destpêk de ji 4 bingehên li pey hev homologî an jî temamker nebe.
8. Nîşanker an jî cihan zêde bikin
5 'dawî bandorek hindik li ser taybetmendiya amplifikasyonê heye û ji ber vê yekê dikare bêyî bandorkirina taybetmendiya amplifikasyonê were guheztin.Guhertina primer 5 'dawî ev e: Zêdekirina malpera sînorkirina enzîmê;Nîşankirî biotin, fluorescence, digoxin, Eu3+, etc.Danasîna cihên mutasyonê, danîn û windakirina rêzikên mutasyonê û danasîna rêzikên promotor, hwd. Bingehên zêde dê kêm-zêde bandorê li karîgeriya zêdekirinê bikin û şansê pêkhatina dimera primerê zêde bikin, lê divê ji bo gava pêş de hin tawîz bên dayîn.Rêzên pêvek ên ku li ser rêzika armancê tune ne, mîna cîhên sînordarkirinê û rêzikên pêşverû, bêyî ku bandorê li taybetmendiyê bikin, dikarin li dawiya 5 'ya primerê werin zêdekirin.Van rêzan di hesabkirina nirxên Tm yên primer de nabin, lê divê ji bo temamkerî û strukturên navîn ên hundurîn werin ceribandin.
9. Subclones
Pirî caran, PCR tenê klonkirina pêşîn e, û dûv re pêdivî ye ku em perçeya armancê di vektorên cihêreng de binxone bikin, ji ber vê yekê divê em ji bo operasyona paşîn di gava PCR de bingehên din dîzayn bikin.
Hin rêzikên ku ji bo subklonkirinê hatine çêkirin li jêr têne kurt kirin.
Malpera sînorkirina endonukleazê ya sînorkirî hate zêdekirin
Zêdekirina malperên sînorkirina enzîmê rêbaza herî gelemperî ye ku ji bo subklonkirina hilberên PCR tête bikar anîn.Bi gelemperî, cîhê veqetandinê şeş bingeh e, ji bilî 5 'dawiya cîhê veqetandinê pêdivî ye ku 2 ~ 3 bingehên parastinê zêde bikin.Lêbelê, hejmara bingehên parastinê yên ku ji hêla enzîmên cûda ve têne xwestin cûda ye.Mînakî, SalⅠ hewceyê bingehek parastinê tune, EcoRⅤ 1 bingehek parastinê, NotⅠ 2 bingehên parastinê, û Hind Ⅲ 3 bingehên parastinê hewce dike.
LIC dûvikê zêde dike
Navê tevahî LIC klonkirina Ligation-Serbixwe ye, rêbazek klonkirinê ye ku ji hêla Navogen ve bi taybetî ji bo beşa wê ya vektora pET ve hatî vedîtin.Hilgira pET-a ku bi rêbaza LIC-ê hatî amade kirin xwedan 12-15-bingehek ne-temamker e 12-15-bingehek yek zencîreyê asê ye, ku li ser perçeya têketina armancê dawiya zeliqandî ya têkildar temam dike.Ji bo mebestên zêdekirinê, rêzika yekem a 5' ya perçeya têxistî divê vektora LIC temam bike.Çalakiya 3'→5' ya derveyî ya T4 DNA polymerase dikare piştî demek kin li ser perçeya ku tê xêzkirin dawiya yek çîçekê çêbike.Ji ber ku hilber tenê dikare ji hevûdu veguheztina perçeya têxê ya amade û vektorê were çêkirin, ev rêbaz pir bilez û bikêr e, û ew klonkirina rêve dibe.
Derhêneriya TA klonê lê zêde bike dûvikê
Klonkirina TA-yê nikarîbû perçeyê di vektorekê de bike armanc, ji ber vê yekê paşê Invitrogen vektorek ku dikare klonkirinê bike armanc, ku çar bingehên GTGGS li yek dawiya wê vedihewîne destnîşan kir.Ji ber vê yekê, di sêwirana primerên PCR de, rêzikên temamker divê li gorî vê werin zêdekirin, da ku perçe bibin "ahengdar".
Ger wextê we kêm be, hûn dikarin senteza rasterast biceribînin, genê bi vektorê re hevber bikin, ya ku em jê re dibêjin senteza genê ET di musekulerîstan de.
D. Rêbaza klonkirina In-Fusion
Ne ligase hewce ye, ne reaksiyonek dirêj hewce ye.Heya ku rêzek li her du dawiya vektora xêzkirî di sêwirana prîmeran de were destnîşan kirin, dûv re hilbera PCR û vektora xêzkirî di nav çareseriya enzîma fusion a ku BSA heye tê zêdekirin û nîv saetê li germahiya odeyê tê danîn, veguherîn dikare were kirin.Ev rêbaz bi taybetî ji bo veguheztina qebareya mezin maqûl e.
10. Merge Primer
Carinan, tenê agahdariya rêzikên tixûbdar di derbarê sêwirana primer de têne zanîn.Mînakî, heke tenê rêzika asîda amînoyî were zanîn, pêşbirka hevgirtinê dikare were sêwirandin.Destpêka yekbûnê tevliheviyek rêzikên cihêreng e ku hemî îmkanên bingehîn ên cihêreng ên ku asîdek amînoyek yekane kod dikin temsîl dike.Ji bo zêdekirina taybetmendiyê, hûn dikarin serî li tabloya karanîna kodonê bidin da ku li gorî vebijarkên karanîna bingehîn ên organîzmayên cihêreng pêvekirinê kêm bikin.Hîpoxanthine dikare bi hemî bingehan re were hev kirin da ku germahiya annealkirinê ya primer kêm bike.Bingehên pêvekirî li dawiya 3'ya primerê bi kar neynin ji ber ku vejandina 3 bazên paşîn li dawiya 3' têra destpêkirina PCR-ê li cîhê xelet e.Pîvana bilindtir a primer (1μM heta 3μM) têne bikar anîn ji ber ku di gelek tevliheviyên pêvekirinê de aşîkar ji şablonê armancê re ne taybetî ne.
Materyalên xav PCRkontrol
1. Hejmara Primer
Giraniya her primer 0,1 ~ 1umol an 10 ~ 100pmol e.Çêtir e ku encama pêwîst bi mîqdara herî kêm a primer were hilberandin.Giraniya bilind a primerê dê bibe sedema nelihevkirin û zêdekirina ne-taybetî, û şansê avakirina dimeran di navbera primeraran de zêde bike.
2. Kêmkirina Primer
Giraniya primers li ser taybetmendiyê bandor dike.Pîvana pêşîn a çêtirîn bi gelemperî di navbera 0.1 û 0.5 μM de ye.Zêdebûna giraniya primer dibe sedema zêdekirina hilberên netaybetî.
3. Germahiya annealing of primer
Parametreyek din a girîng a ji bo primers germahiya helandinê (Tm) ye.Ev germahî ye dema ku 50% ji destpêk û rêzikên temamker wekî molekulên ADN-ê yên dubendî têne xuyang kirin.Tm ji bo danîna germahiya PCR-ê pîjkirinê pêdivî ye.Bi îdeal, germahiya lêdanê têra xwe nizm e ku ji bo pêvekirina bi bandor a primerên bi rêzika armancê re misoger bike, lê têra xwe bilind e ku girêdana netaybetî kêm bike.Germahiya lêdanê ya maqûl ji 55℃ heya 70℃.Germahiya lêdanê bi gelemperî 5 ℃ ji Tm ya primer kêmtir tête danîn.
Ji bo danîna Tm gelek formul hene, ku li gorî formula hatî bikar anîn û rêza primers pir diguhere.Ji ber ku piraniya formulan nirxek Tm ya texmînkirî peyda dikin, hemî germahiyên lêdanê tenê xalek destpêkê ne.Taybetmendî dikare bi analîzkirina çend reaksiyonên ku bi pêşkeftî germahiya annealbûnê bilind dikin were baştir kirin.Di binê Tm-5℃-a texmînkirî de dest pê bikin, û hêdî hêdî germahiya lêdanê bi zêdebûnek 2℃ zêde bikin.Germahiya bilindkirina pijandinê dê avakirina dimerên pêşîn û hilberên ne-taybet kêm bike.Ji bo encamên çêtirîn, her du primera divê nirxên Tm-ê yên nêzik bin.Ger cûdahiya Tm ya cotên primerê ji 5 ℃ zêdetir be, primers dê bi karanîna germahiyek kêmkirina di çerxê de destpêkek xelet a girîng nîşan bidin.Ger her du primerên Tm ji hev cuda bin, germahiya lêdanê ji Tm ya herî kêm 5℃ kêmtir bikin.Alternatîf, ji bo zêdekirina taybetmendiyê, pênc çerx dikarin pêşî li germahiyên pijandinê yên ku ji bo Tm-ya bilindtir hatine çêkirin bêne kirin, li dûv jî çerxên mayî li germahiyên annealkirinê yên ji bo Tm kêmtir hatine çêkirin.Ev dihêle ku kopiyek qismî ya şablona mebestê di bin şert û mercên teng de were bidestxistin.
4. Paqijiya Primer û aramiyê
Paqijiya standard a primerên xwerû ji bo piraniya serîlêdanên PCR-ê têr e.Rakirina komên benzoyl û isobutylyl bi desalkirinê hindik e û ji ber vê yekê mudaxeleyê PCR nake.Hin serîlêdan paqijkirinê hewce dikin ku di pêvajoya sentezê de rêzikên ne-tevahî jêbirin.Van rêzikên qutkirî çêdibin ji ber ku karbidestiya kîmya senteza DNA ne %100 e.Ev pêvajoyek dorhêl e ku reaksiyonên kîmyewî yên dubare bikar tîne ji ber ku her bingehek tê zêdekirin da ku DNA ji 3 'to 5' çêbike.Hûn dikarin di her du qonaxan de têk biçin.Destpêkên dirêjtir, nemaze yên ji 50 bingehî mezintir, xwedan rêjeyek mezin a rêzikên qutkirî ne û dibe ku paqijkirinê hewce bike.
Hilberîna primers ji hêla bandoriya kîmya sentetîk û rêbaza paqijkirinê ve tê bandor kirin.Pargîdaniyên biyodermaceutîkî, wekî Cytology û Shengong, hemî yekîneyek OD-ya herî kêm bikar tînin da ku hilberîna tevahî ya oligonukleosîdê misoger bikin.Pîvanên xwerû di forma toza hişk de têne şandin.Çêtir e ku primerên di TE de ji nû ve werin hilweşandin, da ku berhevoka dawîn 100 μM be.TE ji ava deionîzekirî çêtir e ji ber ku pHya avê bi gelemperî asîd e û dê bibe sedema hîdrolîza oligonukleosîdê.
Stabiliya primers bi şert û mercên hilanînê ve girêdayî ye.Toza hişk û primerên heliyayî divê di -20℃ de werin hilanîn.Primerên ku di TE-yê de di tîrêjên ji 10μM mezintir de têne hilweşandin dikarin 6 mehan li -20℃ bi îstîqrar werin hilanîn, lê tenê dikarin li germahiya odeyê (15℃ heya 30℃) ji 1 hefteyî kêmtir werin hilanîn.Pêşberên toza hişk herî kêm 1 sal di -20 C û heya 2 mehan li germahiya odeyê (15 C heta 30 C) dikarin werin hilanîn.
5. Enzîm û hûrgelên wan
Heya nuha, Taq DNA polîmeraza ku tê bikar anîn bi bingehîn enzîma endezyariya genê ye ku ji hêla bakteriyên kolîformê ve hatî çêkirin.Mîqdara enzîma ku ji bo katalîzkirina reaksiyonek PCR-ya tîpîk hewce ye bi qasî 2,5 U ye (ji 100 ul qebareya reaksiyonê re vedibêje).Ger konsantre pir zêde be, ew dikare bibe sedema zêdekirina ne-taybetî;heke konsantre pir kêm be, dê mîqdara berhema sentetîk kêm bibe.
6. Kalîte û giraniya dNTP
Qalîteya dNTP ji nêz ve bi hûrbûn û bikêrhatina zêdekirina PCR ve girêdayî ye.Toza dNTP granular e, û guhêrbariya wê çalakiya xweya biyolojîkî winda dike heke ew bi xeletî were hilanîn.Çareseriya dNTP asîd e, û pêdivî ye ku di konsantasyona bilind de were bikar anîn, bi çareseriya tamponê ya 1M NaOH an 1M Tris.HCL re ku PH-ya xwe li 7.0 ~ 7.5 eyar bike, mîqdarek piçûk a bin-pakêtê, hilanîna cemidî li -20 ℃.Gelek cemidî-germkirin dê dNTP xirab bike.Di reaksiyona PCR de, dNTP divê 50 ~ 200umol/L be.Bi taybetî, divê bal were kişandin ser giraniya çar DNTPS divê wekhev be (amadekirina molek wekhev).Ger konsantasyona yek ji wan ji yên din cûda be (bilind an kêmtir), dê nehevhatî çêbibe.Kêmbûna pir kêm dê hilberîna hilberên PCR kêm bike.dNTP dikare bi Mg2+ re bikeve hev û giraniya Mg2+ ya belaş kêm bike.
7. Şablon (genê hedef) asîda nukleîk
Mîqdar û dereceya paqijkirina şablonê asîda nukleîk yek ji wan girêdanên bingehîn e ji bo serkeftin an têkçûna PCR.Rêbazên paqijkirina DNA ya kevneşopî bi gelemperî SDS û protease K bikar tînin da ku nimûneyan bişewitînin û avêtin.Karên sereke yên SDS ev in: lîpîd û proteînên li ser parzûna xaneyê bihelîne, bi vî rengî parzûna şaneyê bi helandina proteînên parzûnê hilweşîne, û proteînên nukleerî yên di şaneyê de ji hev veqetîne, SDS jî dikare bi proteînan re bibe yek û bişewitîne;Protease K dikare proteînan, nemaze histonên ku bi DNA ve girêdayî ne, hîdrolîz bike û bişewitîne, û dûv re fenol û kloroformê çareserkerê organîk bikar bîne da ku proteîn û hêmanên din ên hucreyê derxîne, û etanol an alkolê îzopropil bikar bîne da ku asîda nukleîk bibarîne.Asîda nukleîk a ku hatî derxistin dikare wekî şablonek ji bo reaksiyonên PCR were bikar anîn.Ji bo nimûneyên tespîtkirina klînîkî ya gelemperî, rêbazek bilez û hêsan dikare were bikar anîn da ku hucreyan hilweşîne, pathogenan lîz bike, proteînan ji kromozoman berbi genên armancê azad vebike, û rasterast ji bo zêdekirina PCR were bikar anîn.Derxistina şablonê RNA bi gelemperî rêbaza guanidine isothiocyanate an protease K bikar tîne da ku pêşî li hilweşandina RNase RNA bigire.
8.Mg2+ giraniya
Mg2+ bandorek girîng li ser taybetmendî û hilberîna zêdekirina PCR heye.Bi gelemperî reaksiyona PCR-ê, dema ku giraniya dNTP-yên cihêreng 200umol / L e, giraniya guncan a Mg2+ 1,5 ~ 2,0 mmol / L e.Giraniya Mg2+ pir zêde ye, taybetmendiya reaksiyonê kêm dibe, zêdekirina ne-taybetî çêdibe, giraniya pir kêm dê çalakiya Taq DNA polîmerazê kêm bike, di encamê de hilberên reaksiyonê kêm dike.
Iyonên magnesium bandorê li çend aliyên PCR dike, wekî çalakiya DNA polymerase, ku bandorê li hilberînê dike;Nimûneyek din jî annealkirina primer e, ku bandorê li taybetmendiyê dike.dNTP û şablon bi îyona magnesiumê ve girêdidin, mîqdara îona magnesiuma belaş a ku ji bo çalakiya enzîmê hewce dike kêm dike.Pîvana îyona magnesiumê ya çêtirîn ji bo cot û şablonên pêşîn ên cihêreng diguhezîne, lê berhevokek destpêkek PCR ya bi 200μM dNTP 1.5mM e (têbînî: Ji bo PCR-ya mîqdar a di dema rast de, 3 heta 5 mM çareseriya îyona magnesiumê bi sondayek fluorescentî bikar bînin).Girêdanên bilind ên îyonên magnesiumê yên belaş hilberînê zêde dikin, lê di heman demê de zêdekirina netaybetî jî zêde dike û dilsoziyê kêm dike.Ji bo destnîşankirina giraniya çêtirîn, titrasyonên îyonên magnesium bi zêdekirina 0.5mM ji 1mM ber 3mM hatin kirin.Ji bo kêmkirina girêdayîbûna bi optimîzasyona îyona magnesium, platinum Taq DNA polymerase dikare were bikar anîn.Platinum Taq DNA polymerase dikare fonksiyonê li ser rêzek firehtir a hûrgelên îyonên magnesium ji Taq DNA polymerase biparêze û ji ber vê yekê kêmtir xweşbîniyek hewce dike.
9. Pcr-pêşvebirên pêvek
Optîmîzekirina germahiya şilkirinê, sêwirana primerê, û giraniya îyona magnesiumê ji bo zêdekirina pir taybetî ya pir şablonan bes e;lebê, hin şablon, di nav de yên bi naveroka GC bilind, pêwîstî bi tedbîrên zêde.Zêdekirinên ku bandorê li germahiya helandina DNA dikin rêyek din peyda dikin ku taybetmendî û hilberîna hilberê çêtir bikin.Ji bo encamên çêtirîn denaturasyona tevahî ya şablonê hewce ye.
Wekî din, avahiya duyemîn pêşî li girêdana primer û dirêjkirina enzîmê digire.
Pêvekên PCR, di nav de formamide, DMSO, glycerin, betaine, û Çareseriya Enhancer PCRx, amplification zêde dikin.Mekanîzmaya wan a gengaz ew e ku germahiya helandinê kêm bikin, bi vî rengî arîkariya pîvazkirina primmeran dike û arîkariya dirêjkirina DNA polîmerazê di nav devera avahiya duyemîn de dike.Çareseriya PCRx xwedan avantajên din e.Dema ku bi Platinum Taq DNA polymerase û Platinum Pfx DNA polymerase re tê bikar anîn, xweşbîniya îyona magnesiumê ya hindiktirîn pêdivî ye.Bi vî rengî, teknîka Platinum bi lêzêdekirinê re tête hev kirin da ku taybetmendiyê zêde bike di heman demê de girêdayîbûna nêzîkatiya sêyemîn, xweşbîniya îyona magnesium kêm dike.Ji bo encamên çêtirîn, pêdivî ye ku hûrbûna pêvekan were xweşbîn kirin, nemaze DMSO, formamide, û glycerol, ku Taq DNA polymerase asteng dike.
10. Destpêka germ
Destpêka germ PCR yek ji wan rêbazên herî girîng e ku ji bo baştirkirina taybetmendiya PCR ji bilî sêwirana pêşîn a baş.Her çend germahiya dirêjbûna çêtirîn a Taq DNA polymerase 72 ℃ e, polîmeraz li germahiya odeyê çalak dimîne.Bi vî rengî, hilberên ne-taybetî têne hilberandin dema ku germahiya hilgirtinê di dema amadekirina reaksiyona PCR-ê de û di destpêka çerxa germî de ji germahiya annealkirinê kêmtir e.Piştî ku têne çêkirin, ev hilberên netaybetî bi bandor têne zêdekirin.PCR-destpêka germ bi taybetî bi bandor e dema ku cîhên ku ji bo sêwirana pêşîn têne bikar anîn ji hêla cîhê hêmanên genetîkî ve têne sînorkirin, wek mutasyonên ku ji hêla malperê ve têne rêve kirin, klonkirina vegotinê, an çêkirin û manipulasyona hêmanên genetîkî yên ku ji bo endezyariya DNA têne bikar anîn.
Rêbazek hevpar a ji bo sînorkirina çalakiya Taq DNA polymerase ev e ku meriv çareseriya reaksiyona PCR-ê li ser qeşayê amade bike û wê di nav alavek PCR-ya ku ji berê ve hatî germ kirin bi cîh bike.Ev rêbaz hêsan û erzan e, lê ew çalakiya enzîmê temam nake û ji ber vê yekê zêdekirina hilberên ne-taybet bi tevahî ji holê ranake.
Pîvana termal senteza ADNyê dereng dixe bi astengkirina pêkhateyek bingehîn heya ku cîhaza PCR bigihîje germahiya denaturasyonê.Pir awayên destpêkirina termalîkî yên desta, tevî zêdekirina dereng a Taq DNA polîmerazê, bi taybetî ji bo serîlêdanên berbi berbiha giran in.Rêbazên din ên pêşînkirina termal mertalek mûmê bikar tînin da ku hêmanek bingehîn, di nav de îyonên magnesium an enzîman, an jî ji bo veqetandina fîzîkî pêkhateyên reaktîf, wek şablon û tampon, vehewînin.Di dema çerxa germî de, hêmanên cihêreng têne berdan û bi hev re wekî mûm dihele.Mîna rêbaza destpêkirina germ a bi destan, rêbaza mertalê wax-ê giran e û meyla gemarê ye û ji bo serîlêdanên berbi bilind ne maqûl e.
Platinum DNA polymerase ji bo PCR-ya destpêka germê ya otomatîkî rehet û bikêr e.Platinum Taq DNA polymerase ji Taq DNA polîmeraza rekombînant pêk tê ku bi antîpotek monoklonal re li dijî Taq DNA polîmeraza pêk tê.Antîbodî ji hêla PCR ve têne çêkirin ku çalakiya enzîmê di dema dirêjkirina germahiya dirêj de asteng bikin.Taq DNA polymerase di reaksiyonê de di dema însulasyona 94 ℃ ya qonaxa denaturasyonê de hate berdan, çalakiya tevahî polîmerazê nûve dike.Berevajî polîmeraza Taq DNA ya bi kîmyewî guhezbar ji bo destpêkirina termal, enzîma Platinum ji bo çalakkirina polîmerazê li 94℃ (10 heta 15 hûrdem) îzolasyonek dirêj hewce nake.Bi PlatinumTaq DNA polymerase, 90% ji çalakiya Taq DNA polymerase piştî 2 hûrdeman li 94℃ hate vegerandin.
11. Nest-PCR
Germên li pey hev ên zêdekirinê bi karanîna primerên hêlînkirî dikarin taybetmendî û hestiyariyê baştir bikin.Tûra yekem ji 15 heta 20 dewran zêdebûnek standard e.Parçeyek piçûk a hilbera zêdekirina destpêkê 100 heta 1000 carî hate rijandin û ji 15 heta 20 dewran li dora duyemîn a zêdekirinê hate zêdekirin.Alternatîf, hilbera pêşîn a zêdekirî dikare ji hêla paqijkirina gel ve were mezin kirin.Di tûra duyemîn a amplifikasyonê de destpêkek hêlînkirî tê bikar anîn, ku dikare bi rêzika armancê ya di hundurê yekema yekem de girêde.Bikaranîna PCR-ya hêlîn îhtîmala zêdekirina cîhên armancê yên pirjimar kêm dike ji ber ku çend rêzikên armanc hene ku ji her du komên destpêker re temam dikin.Heman jimareya giştî ya dewranan (30 heta 40) bi heman destpêkeran deverên netaybet zêde kirin.Nested PCR hesasiyeta rêzikên armancê yên bisînor zêde dike (mînak, mrnasên kêm) û taybetmendiya PCRS-ya dijwar (mînak 5' RACE) çêtir dike.
12. PCR daketî
PCR-ya daketî bi karanîna şert û mercên hişk ên annealkirinê ji bo çend çerxên pêşîn ên PCR-ê taybetmendiyê çêtir dike.Dewrêş di germahiyek helandinê de bi qasî 5℃ ji Tm ya texmînkirî bilindtir dest pê dike, dûv re her çerxek ji 1℃ heya 2℃ tê kêm kirin heya ku germahiya lêdanê di binê Tm 5℃ de be.Tenê şablona mebestê ya bi homolojiya herî bilind dê were zêdekirin.Van hilberan di çerxên paşerojê de berferehbûna xwe didomînin, hilberên ne-taybetî yên zêdekirî derdixin.PCR-ya daketî ji bo rêbazên ku dereceya homolojiya di navbera primer û şablonê armancê de ne diyar e, wek mînak şopandina tiliya DNA ya AFLP, bikêr e.
Kîtên PCR yên têkildar
2× PCR HeroTMPergala Mix-ê ji pergala PCR Mix-a normal toleransek ji înhîbîtorên PCR-ê re mezintir e, û dikare bi hêsanî bi zêdekirina PCR-ya şablonên cihêreng ên tevlihev re mijûl bibe.Pergala reaksiyonê ya bêhempa û Taq Hero-a-berbiçav dike ku reaksiyona PCR xwedan karîgerî, taybetmendî û hesasiyetek bilindtir e.
Berbiçavkirina zêdekirina zêde
Ew çalakiya 5'→3' DNA polymerase û 5'→3' çalakiya exonuclease heye, bêyî çalakiya 3'→5' exonuklease.
Tampona taybetî-optimîzekirî û enzîma Taq-destpêka germ dikare pêşî li zêdekirina ne-taybet û avakirina dimera pêşîn bigire.
Hesasiya bilind - dikare kopiyên kêm ên şablonê tespît bike
Kit reagentek veguheztina berevajîkirî ya Foregene û Foregene HotStar Taq DNA Polymerase bi pergalek reaksiyonê ya bêhempa ve tê bikar anîn da ku bi bandor karûbarê zêdekirin û taybetmendiya reaksiyonê baştir bike.
Dema şandinê: Gulan-09-2023
