1. Tesbîtkirina vegirtina çareseriya ARNyê
Avgirtin li 280, 320, 230, û 260 nm, bi rêzê, nirxên asîda nukleîk, paşperdeya (tûrbûna çareseriyê), berhevoka xwê, û madeya organîk a wekî proteîn nîşan dide.Bi gelemperî tenê li OD260 / OD280 (Ratio, R) binêrin.Dema ku 1.8 ~ 2.0, em difikirin ku qirêjiya proteîn an madeyên organîk ên din ên di RNA de dikare were tolerans kirin, lê divê were zanîn ku dema ku Tris wekî tampon tê bikar anîn da ku vegirtinê were tesbît kirin, dibe ku nirxa R ji 2 mezintir be (bi gelemperî divê ew <2.2 be).Dema ku R<1.8, qirêjiya proteîn an jî madeyên organîk ên din ên di çareseriyê de diyartir e, û çarenûsa RNA li gorî hewcedariyê dikare were destnîşankirin.Dema ku R>2.2, ev tê wê wateyê ku ARN di nav asîdek nukleîk de hîdrolîz bûye.
2.Nimûneya elektroforetîkî ya ARNyê
Bi gelemperî, gêlê denaturing ji bo elektroforeziya RNA tê bikar anîn, lê heke ew tenê ji bo tespîtkirina kalîteya RNA be, gêlê denaturing ne hewce ye, û gêla agarose ya normal dikare were bikar anîn.Armanca elektroforez ew e ku yekparebûna bandên 28S û 18S û rêjeya wan, an yekparçebûna smear-a ARNyê tespît bike.Bi gelemperî, heke bandên 28S û 18S ronî, zelal û tûj bin (bi navgîniya keviyên bendan zelal in), û ronahiya 28S du qat ji bandên 18S zêdetir be, em qalîteya ARNyê baş dibînin.
Li jor du rêbazên ku em bi gelemperî bikar tînin hene, lê yek ji van her du rêbazan bi zelalî nikare ji me re bêje ka di çareseriya RNA de RNase ya mayî heye an na.Heger di çareseriyê de rêjeyek pir hindik RNase hebe, ji me re zehmet e ku em bi rêbaza jorîn wê tesbît bikin, lê piraniya reaksiyonên enzîmatîk ên paşerojê li ser 37 dereceyan û ji bo demek dirêj têne kirin.Bi vî awayî ger di çareseriya ARNyê de rêjeyek pir hindik RNase hebe, wê demê dê hawîrdorek pir guncaw û dem hebe ku di ceribandinên paşerojê de rola xwe bilîzin û helbet ceribandin dê di vê demê de sar be.Li jêr em rêbazek destnîşan dikin ku dikare piştrast bike ka di çareseriya RNA de RNase ya mayî heye yan na.
3. Testa parastina germê
Li gorî berhevoka nimûneyê, du RNA 1000 ng ji çareseriya ARNyê derxînin û wê li lûleyek santrîfujê ya 0,5 ml zêde bikin, û wê bi pH 7,0 Tris tampon bi tevahî 10 ul zêde bikin, û dûv re kulma boriyê bixin.Yek ji wan têxin nav hemamek avê ya bi germahîya domdar di 70°C de û 1 saetê germ bihêlin.Beşê din 1 saet di sarincokê de -20°C de hate hilanîn.Dema ku dem qediya, du nimûneyên ji bo elektroforezê derxînin.Piştî ku elektroforez qediya, bandên elektroforez ên her duyan bidin ber hev.Ger bandên herduyan hevgirtî bin an cûdahiya wan a girîng tune be (bê guman, bandên wan jî şertên rêbaza 2-ê pêk tînin), ev tê vê wateyê ku di çareseriya RNA de gemariya RNase ya mayî tune, û kalîteya RNA pir baş e.Berevajî vê, heke nimûneya ku di 70°C de hatî înkubakirin, hilweşînek eşkere nîşan bide, ev destnîşan dike ku di çareseriya RNA de gemariya RNase heye.
2 Rêbaz û teknîkên ezmûnî ji bo derxistina RNA
Pirsgirêkên ku em gelek caran di dema derxistina ARNyê de rastî wan tên ev in: (1) Berhema ARNyê kêm e;(2) ARN xwedan qirêjiya xwê ya cidî ye;(3) ARN xwedan qirêjiya ciddî ya şêlê organîk e;(4) hilweşandina nimûne û pirsgirêkên din
1. Bi gelemperî reagentên derxistina RNA yên tevahî têne bikar anîn
Rêbaza isothiocyanate guanidine û rêbaza Trizol rêbazên herî gelemperî yên ku ji bo derxistina ARN-ya tevahî ji tevn û şaneyên heywanan têne bikar anîn in.Ew bi taybetî ji bo nimûneyên piçûk û tevnên ku derxistina wan bi taybetî dijwar e, minasib e, wek mînak derxistina ARN-ya tevahî ji çermê kevroşk û tevna girêdana heywanan;ji bilî vê, Trizol, wekî reagentek lîzê ya gelemperî, dikare ji bo derxistina tevnên nebat, bakterî, fungî û tevnên din jî were bikar anîn.Ji bo tevnên nebatê yên ku polysaccharîd û polyphenol hene, wek camellia oleifera, pelên çayê, tovê raçavê, hwd., rêbaza CTAB jî dikare were bikar anîn da ku RNA-ya tevahî derxîne.
Wekî rêbazek kevneşopî, rêbaza du-stûn di heman demê de ji ber xebata wê ya germahiya normal, ne hewce ye ku RNase lê zêde bike, û ewlehî-bê kloroform, fenol û reagentên organîk ên din ên ji bo derxistinê jî pir populer e.(berhemên pêşniyarkirin )
2. Derxistina ARN ya tevayî ji tevnên heywanan
(1) Biceribînin ku tevna teze hilbijêrin, ger ne taze be (tercîh di nav sê mehan de - 80 ℃ sarincok an jî di nîtrojena şil de cemidî. Dema ku tevnvîsê dibirrin, rasterast li germahiya odeyê qut nekin, teqez Bixin ser qutiya qeşayê, hewl bidin ku ji dûbare cemidandin û helandinê dûr nekevin.
(2) Maqeq û çîçekên paqij bikar bînin da ku perçeyek piçûk ji tevlê qut bikin, hewl bidin ku beşa navendî ya tevneyê dema ku nimûneyê jê bikin, an pêşî perçeya mezin a tevnê ji navîn bibirrin, û dûv re nimûneyê li pozîsyona birîna nû bibirrin.Divê tevna jêkirî bi tevahî were şûştin, tevna hûrkirî têxin nav boriyek EP-ê bêyî RNase, lîzatê lê zêde bikin, tevna hûrkirî divê bi tevahî li ber lîzatê were rijandin û ji bo homojenkirinê amade bibin.
(3) Ji bo tevnên normal, ji bo homojenîzasyonê tevnên bi mezinahiya mungê (30-60 mg) hilbijêrin.Ger tevnvîzek pir proteîn, rûn, an tevnên fîbrî yên zexm ên mîna kezebê dihewîne, bi guncan mîqdara tevnên qutkirî zêde bike an kêm bike (vebijarkî) 10~20 mg hilbijêrin.
(4) Ger masûlkeyên masî, goştê mêşhingiv, jelyfish û tevnên din ên bi naverokek av zêde têne derxistin, divê hêjmara nimûneyê bi guncan were zêde kirin (100-200 mg tê pêşniyar kirin).
(5) Ger şert destûr bidin, tevna heywanan piştî ku bi homojenîzatorek tevnvîsa bilind-derbasdar re were homojenkirin rasterast dikare were derxistin, heke amûrek wusa tune be.
(6) ARNya ku piştî derxistina dawîn tê bidestxistin divê tavilê li ser qutiya qeşayê were danîn da ku hilweşîna ARNyê kêm bibe.
3. Derxistina RNA xaneya heywanan
(1) Hucreyên suspensionê: rasterast santrîfuj bikin û navgînê bavêjin, 1-2 caran bi PBS sterîl bişon, dûv re bi mîqdarek guncan a PBS rawestînin, û dûv re lîzatê ji bo lîzê lê zêde bikin.Piştî ku şilê bi tevahî dakêşin, lîzatê rasterast li şaneyên dagirtî zêde nekin.Ev ê bibe sedem ku pakêta hîstonê ya ku piştî şaneyên lîzkirî yên li ser tebeqeya derve tê berdan, bi derveyê şaneyên dagirtî ve girêdayî be, bi vî rengî têkiliya şaneyên di hundurê pelletê de bi lîzatê re sînordar bike., di encamê de lîza şaneyê netemam û hilberîna RNA kêm dibe.
(2) Hucreyên ku nîv-girêdayî ne an jî ne hişk in: Piştî avêtina navgînê, 1-2 caran bi PBS bişon, dûv re rasterast mîqdarek guncav a PBS-ê hildiweşîne û sêlika çandê bi pîpetek an çekan bifetisîne da ku şaneyan biteqîne, û wan veguhezîne şaneyên bê RNA.Ji bo derxistina lîzatê têxin lûleya EP ya enzîmê.
(3) Hucreyên pêgirtî: pêdivî ye ku pêşî bi trîpsînê were helandin, dûv re di lûleyên EP-ya bê RNase de were berhev kirin, ji bo rakirina supernatant were santrîfuj kirin, 1-2 caran bi PBS were şuştin da ku trîpsîna zêde jê bibe, û bi mîqdarek guncan a PBS-ê ji nû ve were sekinandin Dûv re derbasî qonaxa derxistinê bibin.
4. Derxistina ARN ya nebatê
Tiştên nebatan bi pêkhateyên fenolîk, an ji hêla polysaccharides ve dewlemend in, an hin metabolîtên duyemîn ên nenas dihewîne, an jî xwedan çalakiya RNase ya bilind e.Van maddeyan piştî lîza şaneyê bi ARNyê re hişk têne berhev kirin da ku kompleksên bêçareserî an barkêşên koloidal ava bikin, ku rakirina wan dijwar e.Ji ber vê yekê, dema ku em tevna nebatê derdixin, pêdivî ye ku em ji bo nebatan kîtek hilbijêrin.Lîzata di kîtê de dikare bi bandor pirsgirêkên oksîdasyona hêsan a polîfenolan û veqetandina pêkhateyên polysaccharîd û asîdên nukleîk çareser bike.
(Ji bo derxistina RNA ya nebatê ya polysaccharide polyphenol, hilberên pêşniyar kirin:
(1) Pevçûn, kulîlk, tov, pel û hwd yên nebatê divê bi tevahî di nav hewanê de werin rijandin.Di dema pêvajoya qirkirinê de, divê nîtrojena şil di wextê xwe de were tije kirin da ku nimûneyê nehelîne.Nimûneya erdê divê bi lez li lîzatê were zêdekirin û were hejandin da ku ji hilweşîna ARNyê dûr bikevin.
(2) Ji bo nimûneyên fîber-dewlemend ên wekî pelên birinc û genim, pêdivî ye ku mîqdara derxistinê bi rêkûpêk were kêm kirin, wekî din rijandin û lîzkirina tevneyê dê temam nebe, di encamê de RNA-ya hatî derxistin kêm dibe.
(3) Ji bo tevnên nebatê yên bi naveroka avê ya zêde, wek fêkiyê narînê, fêkiyê zebeş, fêkiyê hirmî, hwd., divê pîvana nimûneyê bi rêkûpêk were zêdekirin (100-200 mg vebijarkî ye).
(4) Tevliheviyên nebatan, wek pelên nebatan, rhizomes, fêkiyên hişk û materyalên din bi gelemperî têne pêşniyar kirin ku nîtrojena şil bikar bînin da ku bi tevahî pêkhateyên di hawanê de bişewitînin, û dûv re derbasî qonaxa derxistinê bibin.Dibe ku homojenîzatorên tevnvîsê yên kevneşopî di homojenkirina tevnên nebatê de ne bandorker bin, û bi gelemperî nayê pêşniyar kirin.
5. Tedbîrên ji bo derxistina RNA
(1) Nimûneyên tevnvîsê divê bi qasî ku pêkan teze bin da ku ji dûbarebûna cemidî û şilbûnê dûr nekevin.
(2) Divê tevne di dema derxistinê de bi tevahî were zevt kirin, û mîqdara tevnê divê ne pir hindik be, bila pir zêde be.
(3) Piştî lêkirina lîzatê divê têra xwe wextê înkubasyonê were dayîn da ku nimûneyê bi tevahî lîz bike.
(4) Dema ku rêbaza Trizol ji bo derxistinê tê bikar anîn, prensîba girtina supernatantê piştî xêzkirinê ev e ku "tercih bikin ku hindiktir bêhna xwe bidin ji pirtir nefesê", û pêdivî ye ku ji tebeqeya navîn dernekeve, wekî din ew ê bibe sedema tevliheviyek cidî ya DNA-ya genomîkî.
(5) Dema şuştinê, pêdivî ye ku şilava şuştinê bi tevahî li dora dîwarê boriyê bişewitîne da ku şuştina bêkêmasî bicîh bîne.
(6) Ji bo rêbaza derxistina stûnê, ji bilî veqetandina stûnê piştî şuştinê, stûna adsorptionê jî divê di nav bencek ultra-paqij de were danîn û 5-10 hûrdeman bişewitîne da ku rûnê organîk bi tevahî zuwa bibe.
(7) Di şuştina paşîn a rêbaza stûnê de, piştî lê zêdekirina ava DEPC, divê ew 3-5 hûrdeman were înkubakirin, an jî ava DEPC divê pêşî li 60 °C were germ kirin da ku hilberîna şûştinê zêde bike.Di rêbaza şilkirina kevneşopî ya Trizol û barîna isopropanol de, RNA ya paşîn di ava DEPC de tê hilweşandin, ji ber vê yekê divê demek guncan ji bo hilweşandinê were dayîn, û binê lûleya santrîfujê bi domdarî bi tîpek pîpetê were avêtin.
3 Three Sedem û çareseriyên ji bo giraniya kêm RNA / kalîteya xirab
1. Berhem pir kêm e
Nimûneya ku hatî derxistin pir kêm e, hêjmara giştî têrê nake, an jî nimûneya hatî derxistin pir zêde ye û lîz ne temam e;Divê tevnek an şaneyên bi qalîteya guncav ji bo derxistinê werin bikar anîn, divê pêşî dermankirina nimûneyê baş were kirin û lîz bes be.
2. Bermahiyên genomê
Dema ku bi rêbaza Trizolê tê derxistin, dema ku supernatant piştî qatkirinê di tebeqeya navîn de were mêjandin, dê tevliheviyek cidî ya genomê çêbibe;Di dema qatkirinê de divê baldariyek zêde were girtin da ku di qata navîn de mêj neke.Ger rêbaza stûnê ji bo derxistinê were bikar anîn, kîtek ku DNase I heye dikare ji bo derxistinê were hilbijartin.Asîda nukleîk a ku li ser membranê tê kişandin rasterast bi DNase I-yê re tê xwar, ku dikare bermahiyên DNA-yê pir kêm bike.
3. Xerabûna ARN
Dibe ku ew hilweşîna nimûneya derxistinê bixwe be, an jî hilweşîna ku di dema pêvajoya derxistinê de çêdibe;Bi qasî ku pêkan be, divê nimûneyên teze ji bo derxistina ARNyê werin bikar anîn, û nimûneyên hatine berhev kirin divê di wextê xwe de di nîtrojena şil an sarincoka -80°C de werin hilanîn, û ji cemidandin û şilbûna dubare dûr bê girtin.Divê di pêvajoya derxistina RNA de serişteyên bêyî RNase/DNase, lûleyên santrîfujê û materyalên din werin bikar anîn.Pêvajoya derxistinê divê bi qasî ku gengaz be.Divê ARNya ku hatiye derxistin li ser qutiyeke qeşayê were danîn û di dema -80 de were hilanîn.Ger hewce bike ku ARNya ku hatiye derxistin bi elektroforezê gel were tesbît kirin, divê elektroforez tavilê piştî derxistinê were kirin, û tampona elektroforezê bi ya nû hatî amadekirin were guheztin.
4. Salt û bermahiyên solver organîk
Reagentên derxistinê xwêyên fenol û guanidine hene, û çareseriya şuştinê etanolê heye.Di dema pêvajoya derxistinê de, lîzate bi tevahî nehat avêtin û avêtin, û çareseriya şuştinê bi tevahî zuwa nebû.Xwêyên bermayî û halên organîk ji bo transkrîpsiyona berevajî û PCR ya paşîn zirardar in.Dereceyên cûda yên astengkirinê, ji ber vê yekê divê di pêvajoya derxistinê de lîzata tevnê bi tevahî were rakirin, û pêdivî ye ku şuştin bes be da ku dîwarên derdorê yên boriyê bêne şuştin.Digel vê yekê, valakirina boriyê û avêtinê gavek pêdivî ye, ku dê bermayiya madeya organîk bêtir kêm bike.
Ji bo bêtir agahdarî di derbarê derxistina RNA de, ji kerema xwe malpera me bişopînin:
Ji bo bêtir agahdarî www.foreivd.com.
Dema şandinê: Dec-01-2022
